人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微泡對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血淋巴細(xì)胞及炎性因子的影響.pdf

1、背景：
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種慢性、系統(tǒng)性、炎癥性自身免疫性疾病，其病理改變是機(jī)體免疫功能紊亂導(dǎo)致的滑膜增生、血管翳形成、骨及軟骨組織的破壞。有研究的表明，Treg/Th17細(xì)胞的平衡失調(diào)對RA的發(fā)生、發(fā)展起著至關(guān)重要的作用[1,2]。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchyma Stem Cells,MSCs）已被證實(shí)是一種具有高度增值能力和多向分化潛能的細(xì)胞[3]，可通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞及因

2、子的表達(dá)，達(dá)到治療RA的目的。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的微泡（Mesenchymal Stem Cells derived Microvesicles，MSC-MVs）同樣具有免疫調(diào)節(jié)作用[5]，同時可避免細(xì)胞治療引起的血管栓塞、異位成骨等風(fēng)險(xiǎn)，因此逐漸成為新型的研究熱點(diǎn)。
　　目的：
　　通過體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cordmesenchymal stem cells, hUC-

3、MSCs）及分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的微泡（human umbilical cord mesenchymal stem cells derived microvesicles, hUCMSC-MVs），將hUCMSC-MVs與RA患者外周血單個核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs）體外共培養(yǎng)，觀察hUCMSC-MVs對RA患者PBMC中Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞及炎性因子IL-17A

4、、IL-1a、IL-2、TNF-α、TGF-β、IL-10表達(dá)的影響，探討hUCMSC-MVs治療RA是否有效，作用強(qiáng)度如何，是否與其濃度相關(guān)，進(jìn)而從炎癥細(xì)胞及因子途徑闡述hUCMSC-MVs治療RA可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.hUC-MSCs和hUCMSC-MVs的分離、鑒定
　?。?）hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：采用組織塊培養(yǎng)方法體外分離、培養(yǎng)hUC-MSCs，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢

5、測表面抗原CD29、CD44、CD105、CD73、CD90、CD166、CD34、CD45，并在特定條件下對hUC-MSCs的成骨、成脂分化潛能進(jìn)行鑒定；
　　（2）hUCMSC-MVs的分離和鑒定：hUC-MSCs“饑餓”培養(yǎng)24小時，使用差速離心提取上清液中的微泡，使用透射電鏡觀察其形態(tài)，并采用BCA方法在酶標(biāo)儀上測定其蛋白質(zhì)含量。
　　2.hUCMSC-MVs與RA患者PBMCs共培養(yǎng)，觀察其對Th17細(xì)胞、Treg

6、細(xì)胞及相關(guān)炎性因子表達(dá)水平的影響
　?。?）實(shí)驗(yàn)分組：共5組，分別是空白對照組、hUC-MSCs組（2×106個）、hUCMSC-MVs組（30μg）、hUCMSC-MVs組（60μg）、hUCMSC-MVs組（90μg）。
　?。?）檢測指標(biāo)：⑴流式細(xì)胞術(shù)測定Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞表達(dá)水平。⑵流式高通量多因子檢測技術(shù)測定培養(yǎng)上清中促炎因子IL-17A、IL-1a、IL-2、TNF-α和抗炎因子TGF-β、IL-10的表

7、達(dá)水平，收集數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1.hUC-MSCs和hUCMSC-MVs的分離、鑒定
　?。?）hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞排列較整齊，呈較為均一的長梭形，類似成纖維細(xì)胞樣外觀。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，細(xì)胞表面CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166呈陽性表達(dá)，CD34、CD45成陰性表達(dá)。hUC-MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化，鈣鈷法染色成陽性；經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化，油紅

8、O染色成陽性；
　?。?）hUCMSC-MVs的分離和鑒定：經(jīng)透射電鏡觀察，顯示離心所得產(chǎn)物為一類直徑介于40nm-300nm之間大小不一的囊泡狀結(jié)構(gòu)，重懸后蛋白質(zhì)濃度約2.05μg/μl。
　　2.hUCMSC-MVs在體外與RA患者PBMC混合培養(yǎng)
　　（1）各實(shí)驗(yàn)組均可下調(diào)Th17細(xì)胞及IL-17A、IL-2、IL-1、TNF-α的表達(dá)，增加Treg細(xì)胞表達(dá)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；hUCMSCs組和中

9、、高濃度MVs組均可上調(diào)TGF-β、IL-10水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；
　　（2）高濃度MVs組在下調(diào)Th17細(xì)胞及IL-17A、IL-1a、TNF-α的表達(dá)和增加Treg細(xì)胞及TGF-β、IL-10的表達(dá)方面，作用優(yōu)于低、中濃度MVs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；
　　（3）高濃度MVs組和hUC-MSCs組均可下調(diào)Th17細(xì)胞及IL-17A、IL-1a、TNF-α的表達(dá)，增加IL-10的表達(dá)，差別