CaMKⅡδ可變剪接及CaN去磷酸化調(diào)控在大鼠早期心臟重構(gòu)中的作用.pdf

1、心臟重構(gòu)（cardiac remodeling, CR）指一系列可造成心肌組織及血管重構(gòu)的病理過(guò)程，早期表現(xiàn)為心肌肥厚，晚期則表現(xiàn)為心臟擴(kuò)大、心力衰竭。但其機(jī)理尚有待進(jìn)一步明確。近年研究表明心肌細(xì)胞內(nèi) Ca2+平衡的失調(diào)是導(dǎo)致心肌肥厚的最基本因素。鈣/鈣調(diào)素依賴(lài)蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ, Ca2+/CaMKⅡ)是一種多功能的蛋白激酶,作為Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子，能

2、夠調(diào)節(jié)細(xì)胞多種功能。CaMKⅡ通過(guò)調(diào)節(jié)鈣代謝的各個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)影響心肌細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和興奮-收縮偶聯(lián)。有研究表明，在心肌肥厚或心衰等心臟重構(gòu)過(guò)程中, CaMKⅡ細(xì)胞內(nèi)表達(dá)升高。
　　CaMKⅡ有α、β、γ和δ四種亞型，它們分布于不同組織。心臟組織中主要表達(dá)CaMKⅡ的δ亞型。CaMKⅡδ亞型由于外顯子14、15或者16可變剪接，可表達(dá)A、B、C多種CaMKⅡδ變異體（isoform）。CaMKⅡδA含有外顯子15和16，但不含有外顯子14

3、（含有核定位信號(hào)，Nuclear locolizaton signal, NLS)，主要分布在心臟細(xì)胞的T管區(qū)。前期研究發(fā)現(xiàn)正常機(jī)體內(nèi)CaMKⅡδ外顯子14，15和16的可變剪接受著嚴(yán)格的調(diào)節(jié)控制，一旦此可變剪接的調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，會(huì)造成A、B和C三種變異體的表達(dá)失衡，導(dǎo)致心肌細(xì)胞正常功能的喪失而引起心臟疾病。
　　前期圍繞CaMKⅡδ可變剪接的離體細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞內(nèi)存在雙特異性絡(luò)氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1A(dual-specifici

4、ty tyrosine-phosphorylated and regulated kinase1A, Dyrk1A)經(jīng)可變剪接因子因子（alternative splicing factor，ASF）調(diào)控CaMKⅡδ的可變剪接的信號(hào)通路。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，探討該通路在多種原因所致的心臟早期重構(gòu)——心肌肥厚中的作用。
　　胞內(nèi)鈣離子濃度升高不僅可活化鈣依賴(lài)的蛋白激酶，還可以活化鈣/鈣調(diào)素活化的磷酸酶。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calc

5、ineurin, CaN）是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一受鈣/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，活化后可導(dǎo)致下游底物——NFAT的去磷酸化并核轉(zhuǎn)移，活化抗凋亡和肥厚基因，從而在多種原因所致的心肌肥厚中發(fā)揮重要作用，抑制CaN信號(hào)通路可預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌肥厚。傳統(tǒng)認(rèn)為CaN的活化是由胞內(nèi)鈣離子濃度升高致CaN變構(gòu)，抑制區(qū)移位所致，前期我們發(fā)現(xiàn)CaN的活化還存在蛋白和基因水平的調(diào)節(jié)，活化的CalpainⅠ可導(dǎo)致CaN含自主抑制區(qū)的羧基端的蛋白水解，致Ca

6、N的持續(xù)活化。近期有關(guān)CaMKⅡ與CaN關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ的活化可導(dǎo)致CaN的磷酸化，從而抑制CaN活性和NFAT的核轉(zhuǎn)移。據(jù)此我們推測(cè)CaMKⅡδ可變剪接的信號(hào)通路還存在對(duì)CaN功能的調(diào)節(jié)。
　　本課題旨在探討CaMKⅡδ可變剪接和CaN去磷酸化調(diào)控在多種原因（基因突變、體液因素活化、壓力超負(fù)荷）所致心臟早期重構(gòu)——心肌肥厚中的作用；和CaMKⅡδ可變剪接的信號(hào)通路對(duì)CaN去磷酸化調(diào)控的影響。
　　研究目的：

7、　　1、探討CaMKⅡδ可變剪接及CaN去磷酸化調(diào)控在基因突變所致心肌肥大中的作用。
　　2、探討CaMKⅡδ可變剪接及CaN去磷酸化調(diào)控在體液因素活化所致心肌肥厚中的作用。
　　3、探討CaMKⅡδ可變剪接及CaN去磷酸化調(diào)控在壓力負(fù)荷增加所致心肌肥厚中的作用。
　　研究方法：
　　1、構(gòu)建大鼠心肌肌鈣蛋白ⅠD128Y基因突變重組腺病毒載體，經(jīng)DNA測(cè)序、免疫印跡和細(xì)胞培養(yǎng)等方法鑒定成功后，病毒擴(kuò)增純化，確定M

8、OI后，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞。鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)結(jié)合實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)ANF和BNP mRNA表達(dá)證實(shí)細(xì)胞肥大后，蛋白免疫印跡和 PCR及活性測(cè)定檢測(cè)胞內(nèi) CaN、calpainⅠ、Dyrk1A、ASF和CaMKⅡδ的變化。
　　2、兩腎一夾法制定腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚模型，分別給予Dyrk1A抑制劑EGCG、Harmine，或血管緊張素受體阻滯劑纈沙坦干預(yù)，檢測(cè)大鼠血壓，行心臟重量學(xué)和病理學(xué)測(cè)定作為大鼠肥厚指標(biāo)，蛋白免疫印跡和P

9、CR及活性測(cè)定檢測(cè)胞內(nèi)CaN、calpainⅠ、Dyrk1A、ASF和CaMKⅡδ的變化。
　　3、腹主動(dòng)脈縮窄法制定壓力負(fù)荷增加的大鼠心肌肥厚模型，分別給予Dyrk1A抑制劑EGCG、交感神經(jīng)抑制劑美托洛爾和calpainⅠ抑制劑干預(yù)，檢測(cè)大鼠血壓，同時(shí)行心臟重量學(xué)和病理學(xué)測(cè)定作為大鼠肥厚指標(biāo)，蛋白免疫印跡和PCR及活性測(cè)定檢測(cè)胞內(nèi)CaN、calpain、Dyrk1A、ASF和CaMKⅡδ的變化。
　　研究結(jié)果
　　

10、（一）CaMKⅡδ可變剪接及 CaN去磷酸化調(diào)控在基因突變致大鼠心肌肥大中的作用
　　1、大鼠心肌肌鈣蛋白ⅠD128Y基因突變重組腺病毒載體構(gòu)建：
　　構(gòu)建大鼠心肌肌鈣蛋白ⅠD128Y基因突變重組腺病毒載體，經(jīng)DNA測(cè)序、免疫印跡和細(xì)胞培養(yǎng)等方法鑒定證實(shí)。
　　2、CaN去磷酸化調(diào)控在cTnⅠD128Y突變致大鼠心肌肥大中的作用：
　　與空白對(duì)照組、陰性病毒對(duì)照組或野生型cTnⅠ基因轉(zhuǎn)染組相比，cTnⅠD128Y

11、突變基因轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞增大，胞內(nèi)ANF、BNP mRNA表達(dá)上調(diào)，同時(shí)CaN活性增加和mRNA表達(dá)上調(diào)。CaN抑制劑CsA或FK506干預(yù)在降低CaN活性和mRNA表達(dá)同時(shí)，大鼠心肌細(xì)胞縮小、胞內(nèi)ANF、BNP的mRNA表達(dá)下調(diào)。
　　3、CaMKⅡδ可變剪接調(diào)控在cTnⅠD128Y突變致大鼠心肌肥大中的作用：
　　與對(duì)照組相比，cTnⅠD128Y突變基因轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞內(nèi)ANF、BNP mRNA表達(dá)上調(diào)，心肌細(xì)胞增大同時(shí)，胞

12、內(nèi)存在CaMKⅡδ蛋白表達(dá)上調(diào)、可變剪接紊亂，胞漿內(nèi)ASF表達(dá)下降及Dyrk1A蛋白表達(dá)上調(diào)和活性增加，CalpainⅠ蛋白表達(dá)及活性升高。
　　與單純轉(zhuǎn)染 cTnⅠD128Y突變基因組相比，突變病毒轉(zhuǎn)染并 Dyrk1A抑制劑EGCG或Harimen干預(yù)組細(xì)胞重構(gòu)改善同時(shí)CaMKⅡδ蛋白表達(dá)下調(diào)、可變剪接紊亂改善，胞漿內(nèi)ASF表達(dá)增加及Dyrk1A蛋白表達(dá)下調(diào)和活性下降，但Calpain I蛋白表達(dá)及活性無(wú)變化。
　　與僅轉(zhuǎn)

13、染 cTnⅠD128Y突變基因組相比，突變病毒轉(zhuǎn)染并 Calpain抑制劑MDL28170干預(yù)組在細(xì)胞重構(gòu)改善同時(shí)，存在CalpainⅠ蛋白表達(dá)下調(diào)、活性下降， CaMKⅡδ蛋白表達(dá)下調(diào)、可變剪接紊亂改善，胞漿內(nèi)ASF表達(dá)增加及Dyrk1A蛋白表達(dá)下調(diào)和活性下降。
　　（二）CaMKⅡδ可變剪接及 CaN去磷酸化調(diào)控在神經(jīng)體液因素活化的腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚中的作用：
　　1、CaMKⅡδ可變剪接調(diào)控在腎血管性高血壓大鼠

14、心肌肥厚中的作用：
　　與假手術(shù)組相比，兩腎一夾術(shù)后8周，兩腎一夾組大鼠在血壓升高，左室重與體重比值增加，并心肌細(xì)胞面積增大同時(shí)，大鼠心肌CaMKⅡδ可變剪接紊亂、Dyrk1A蛋白表達(dá)上調(diào)及ASF表達(dá)下降；與兩腎一夾組相比，Dyrk1A抑制劑EGCG或Harnine干預(yù)組在不降低血壓情況下抑制大鼠心肌肥厚，改善CaMK IIδ可變剪接紊亂、Dyrk1A蛋白表達(dá)下調(diào)及胞漿ASF蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。
　　2、CaMKⅡ

15、δ可變剪接調(diào)控及逆轉(zhuǎn)機(jī)制在纈沙坦預(yù)防腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚中的作用：
　　與假手術(shù)組相比，兩腎一夾術(shù)后8周，手術(shù)組大鼠在血壓升高同時(shí)發(fā)生心肌肥厚，心肌CaMKⅡδ可變剪接紊亂、Dyrk1A蛋白表達(dá)上調(diào)及ASF表達(dá)下降；與兩腎一夾組相比，血管緊張素受體阻滯劑纈沙坦干預(yù)組血壓顯著下降，心肌肥厚程度減輕同時(shí)，CaMKⅡδ可變剪接紊亂改善、Dyrk1A蛋白表達(dá)下調(diào)及胞漿ASF蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。
　　3、纈沙坦經(jīng)抑制C

16、alpainⅠ、CaN和CaMKⅡδ可變剪接預(yù)防腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚：
　　與假手術(shù)組相比，兩腎一夾術(shù)后8周，手術(shù)組大鼠在血壓升高、心肌肥厚同時(shí)，心肌中CaN的mRNA、蛋白表達(dá)上調(diào)，活性增加；CaMKⅡδ可變剪接紊亂、Calpain蛋白表達(dá)上調(diào)。與兩腎一夾組相比，纈沙坦干預(yù)組血壓顯著下降，心肌肥厚程度減輕同時(shí)，CaN的活性、mRNA及蛋白表達(dá)均下降，CaMKⅡδ可變剪接紊亂改善、CalpainⅠ蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05）

17、。
　?。ㄈ〤aMKⅡδ可變剪接及CaN去磷酸化調(diào)控在壓力超荷致大鼠心肌肥厚中的作用
　　1、CaMKⅡδ可變剪接調(diào)控在腹主動(dòng)脈縮窄大鼠心肌肥厚中的作用
　　腹主動(dòng)脈縮窄的方法建造壓力負(fù)荷增加的大鼠模型。術(shù)后4周，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組大鼠血壓顯著升高，并心肌肥厚，同時(shí)大鼠心肌CaMKⅡδ可變剪接紊亂、Dyrk1A蛋白表達(dá)上調(diào)及ASF表達(dá)下降；與手術(shù)組相比，Dyrk1A抑制劑EGCG干預(yù)組在不降低血壓情況下抑制大鼠心

18、肌肥厚，改善 CaMKⅡδ可變剪接紊亂、Dyrk1A蛋白表達(dá)下調(diào)及胞漿ASF蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。
　　2、美托洛爾對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄大鼠心肌CaMKⅡδ可變剪接調(diào)控的影響
　　與假手術(shù)組相比，腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后4周，手術(shù)組大鼠在血壓升高同時(shí)發(fā)生心肌肥厚，心肌CaMKⅡδ可變剪接紊亂、Dyrk1A蛋白表達(dá)上調(diào)及ASF表達(dá)下降；與手術(shù)組相比，交感神經(jīng)β受體阻滯劑美托洛爾干預(yù)組血壓顯著下降，心肌肥厚程度減輕同時(shí)，CaMKⅡδ可

19、變剪接紊亂改善、Dyrk1A蛋白表達(dá)下降及胞漿ASF蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。
　　3、MDL28170對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄大鼠心肌肥厚的影響：
　　與假手術(shù)組相比，兩腎一夾術(shù)后8周，手術(shù)組大鼠在血壓升高、心肌肥厚同時(shí)，心肌中CaMKⅡδ可變剪接紊亂、CaN的mRNA、蛋白表達(dá)上調(diào)，活性增加，并Dyrk1A蛋白表達(dá)上升及ASF表達(dá)下調(diào)，Calpain蛋白表達(dá)上調(diào)。與手術(shù)組相比， MDL28170干預(yù)組在不影響血壓情況下，心肌肥

20、厚程度減輕同時(shí)，CaMKⅡδ可變剪接紊亂改善，CaN的活性、mRNA及蛋白表達(dá)均下降，Dyrk1A蛋白表達(dá)下調(diào)及胞漿ASF蛋白表達(dá)增加，CalpainⅠ蛋白表達(dá)下降（P<0.05）。
　　結(jié)論
　　1、CaMKⅡδ可變剪接及CaN去磷酸化調(diào)控通路參與了cTnⅠD128Y基因突變所致的心肌肥大。
　　2、CaMKⅡδ可變剪接及CaN去磷酸化調(diào)控通路參與了兩腎一夾所致大鼠心臟早期重構(gòu)——心肌肥厚的過(guò)程；纈沙坦可通過(guò)調(diào)控這些