g10-L翻譯增強(qiáng)序列提高外源蛋白表達(dá)的初步研究.pdf

1、葉綠體基因工程是高效表達(dá)外源蛋白的有效途徑之一。與核轉(zhuǎn)化技術(shù)相比，具有許多優(yōu)點(diǎn):如基因拷貝數(shù)多，表達(dá)率高，遺傳性狀穩(wěn)定，生物安全性高，能夠避免基因沉默和位置效應(yīng)等。翻譯效率是決定表達(dá)能力的關(guān)鍵因素，一些翻譯增強(qiáng)子能明顯提高重組蛋白的表達(dá)。來(lái)源于T7噬菌體基因10前導(dǎo)序列(g10-L)的一段九個(gè)堿基的翻譯增強(qiáng)子序列(UUAACUUUA)已被證實(shí)在大腸桿菌中能明顯提高多種外源基因表達(dá)產(chǎn)量達(dá)40～340倍，其原理可能是增強(qiáng)mRNA與16S核糖

2、體的識(shí)別結(jié)合能力進(jìn)而促進(jìn)翻譯。
　　 實(shí)現(xiàn)葉綠體轉(zhuǎn)化需要一個(gè)有效的轉(zhuǎn)化載體，這種轉(zhuǎn)化載體中必須具備幾個(gè)基本元件:同源重組的同源臂、完整的外源基因表達(dá)盒（包括啟動(dòng)子、目的基因和調(diào)控序列）、篩選標(biāo)記基因。Lux Ct是以熒光素酶基因Lux AB為基礎(chǔ)進(jìn)行適當(dāng)改造而成，含有高效的內(nèi)源性atpA基因啟動(dòng)子及5'UTR和3'UTR，表達(dá)盒為atpA5'UTR-gfp基因-rbcL3'UTR。Lux Ct為一種穿梭載體，既可以在原核生物中表

3、達(dá)，也可以在真核生物中表達(dá)，但是不能進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是血管生成依賴性過(guò)程。Canstatin是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性血管生成抑制因子，為Ⅳ型膠原α2鏈的非膠原區(qū)。在體外，它能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生、遷移，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;在體內(nèi)，能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。目前，通過(guò)抑制血管生成的這種“休眠療法”在臨床應(yīng)用上具有更廣闊的應(yīng)用前景。我們?cè)诒狙芯恐袠?gòu)建含有人Canstatin的重組表達(dá)載體，通過(guò)檢測(cè)Cansta

4、tin蛋白表達(dá)量的變化來(lái)驗(yàn)證g10-L翻譯增強(qiáng)序列提高外源蛋白表達(dá)的功能。
　　 方法:
　　 我們首先根據(jù)Genbank上登錄的人Canstatin cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以提取的人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞總RNA為模板，利用RT-PCR的方法克隆出人Canstatin基因全長(zhǎng)，以及分別在5'UTR下游和3'UTR上游添加了g10-L翻譯增強(qiáng)序列(UUAACUUUA)的人Canstatin基因片段，并將其分別克隆在pM

5、D18-T載體上并用PaeR7 I、SphI進(jìn)行酶切鑒定。然后利用酶切、連接等方法將表達(dá)盒為atpA5，UTR-gfp基因-rbcL3'UTR的Lux Ct構(gòu)建成表達(dá)盒為atpA5，UTR-canstatin基因-rbcL3，UTR的人Canstatin葉綠體表達(dá)載體，同時(shí)分別構(gòu)建在5，UTR下游和3，UTR上游添加了g10-L翻譯增強(qiáng)序列的葉綠體表達(dá)載體，并用PaeR7 I、Sph I進(jìn)行酶切鑒定。之后為了能夠分別在5'UTR上游和3

6、'UTR下游添加g10-L翻譯增強(qiáng)序列，對(duì)第一部分的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行補(bǔ)充，我們又采用一種新的方法。以構(gòu)建好的不添加g10-L翻譯增強(qiáng)序列的表達(dá)盒為atpA5'UTR-canstatin基因-rbcL3，UTR的重組載體為模板，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物進(jìn)行PCR，分別擴(kuò)增得到在5，UTR上游、3，UTR下游添加g10-L翻譯增強(qiáng)序列的atpA5'UTR-canstatin基因-rbcL3'UTR片段。之后分別連接在pMD18-T載體上并用Ava I、SphI

7、進(jìn)行酶切鑒定，則分別在5，UTR上游、3'UTR下游添加g10-L翻譯增強(qiáng)序列的原核表達(dá)載體構(gòu)建完成。最后，將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體分別在大腸桿菌DH5α中進(jìn)行原核表達(dá)，提取蛋白，并用western blotting的方法進(jìn)行檢測(cè)，初步驗(yàn)證g10-L翻譯增強(qiáng)序列（UUAACUUUA）提高外源蛋白表達(dá)的功能。
　　 結(jié)果:
　　 1.人Canstatin基因片段以及分別在5'UTR下游、3'UTR上游添加g10-L翻譯增強(qiáng)序

8、列(UUAACUUUA)的人Canstatin基因片段的擴(kuò)增
　　 用TRIzol試劑提取A549細(xì)胞總RNA，28S和18S條帶清楚，說(shuō)明純度較高。利用RT-PCR方法得到700 bp左右的人Canstatin基因全長(zhǎng)以及添加了g10-L翻譯增強(qiáng)序列的人Canstatin基因片段，并且克隆在pMD18-T載體上，酶切鑒定正確。
　　 2.人Canstatin葉綠體表達(dá)載體以及分別在5'UTR下游、3'UTR上游添加g1

9、0-L翻譯增強(qiáng)序列(UUAACUUUA)的人Canstatin葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 利用酶切、連接的方法構(gòu)建了表達(dá)盒為atpA5'UTR-canstatin基因-rbcL3，UTR的人Canstatin葉綠體表達(dá)載體，同時(shí)分別構(gòu)建在5'UTR下游和3'UTR上游添加了g10-L翻譯增強(qiáng)序列的人Canstatin葉綠體表達(dá)載體，并經(jīng)酶切鑒定說(shuō)明構(gòu)建成功。
　　 3.補(bǔ)充構(gòu)建分別在5'UTR上游、3'UTR下游添加g1

10、0-L翻譯增強(qiáng)序列(UUAACUUUA)的人Canstatin原核表達(dá)載體
　　 按照上述方法進(jìn)行構(gòu)建，經(jīng)酶切鑒定結(jié)果表明分明在5'UTR上游、3'UTR下游添加g10-L翻譯增強(qiáng)序列的表達(dá)盒為atpA5'UTR-canstatin基因-rbcL3'UTR的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，對(duì)第一部分載體的構(gòu)建進(jìn)行了補(bǔ)充。同時(shí)也構(gòu)建了不添加翻譯增強(qiáng)序列以及分別在5'UTR下游、3'UTR上游添加g10-L翻譯增強(qiáng)序列的人Canstatin原

11、核表達(dá)載體。
　　 4.人Canstatin蛋白的原核表達(dá)以及western blotting檢測(cè)
　　 將兩組構(gòu)建好的重組表達(dá)載體分別在大腸桿菌DH5α中進(jìn)行原核表達(dá)，提取蛋白，之后進(jìn)行western blotting檢測(cè)。結(jié)果顯示在24 KDa處出現(xiàn)特異性條帶，并且添加了g10-L翻譯增強(qiáng)序列的表達(dá)載體的條帶要強(qiáng)于沒(méi)有添加翻譯增強(qiáng)序列的表達(dá)載體的條帶，說(shuō)明蛋白表達(dá)量有所提高?？梢猿醪秸f(shuō)明g10-L增強(qiáng)序列(UUAAC

12、UUUA)對(duì)外源蛋白的表達(dá)有增強(qiáng)作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究成功構(gòu)建了人Canstatin葉綠體表達(dá)載體以及分別在5'UTR下游、3'UTR上游添加了g10-L翻譯增強(qiáng)序列的人Canstatin葉綠體表達(dá)載體。
　　 2.本研究成功構(gòu)建了人Canstatin原核表達(dá)載體以及分別在5'UTR上游下游、3'UTR上游下游添加了g10-L翻譯增強(qiáng)序列的人Canstatin原核表達(dá)載體。
　　 3.We