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文檔簡介
1、背景和目的: 本次實(shí)驗(yàn)研究充分使用改良培養(yǎng)方法和RT-PCR作為檢測手段,兩者優(yōu)劣互補(bǔ),既可利用RT-PCR在較短時(shí)間內(nèi)提供結(jié)果供臨床醫(yī)生參考,又可利用改良培養(yǎng)方法對RT-PCR結(jié)果進(jìn)行再次驗(yàn)證以及對所分離的致病株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。此外,兩者同時(shí)使用還可以提高檢出率。 目前,在中國或其他一些發(fā)達(dá)國家,由于近年來Y.e的臨床流行病學(xué)資料缺乏以致許多醫(yī)生不了解或較少關(guān)注耶爾森菌病的發(fā)生。此外,培養(yǎng)方法繁瑣費(fèi)時(shí)且檢出率低,所以在以
2、前單純利用培養(yǎng)方法檢測腹瀉糞便中的Y.e會(huì)降低檢出率或發(fā)病率,難以真實(shí)反映客觀情況。因此在這次研究中,我們采集大量(2600例)腹瀉糞便并利用已建立的RT-PCR和改良培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測,目的是:1、初步探討近年Y.e感染在腹瀉病人中的臨床特征,包括發(fā)病率、傳染源、臨床表現(xiàn)、并發(fā)癥、治療和預(yù)后,為醫(yī)生提供有價(jià)值的臨床信息;2、再次驗(yàn)證RT-PCR和改良培養(yǎng)方法的吻合度,為臨床提供快速檢測。 材料和方法: 一、樣本來源和病人
3、信息記錄 于2005年5月至2008年5月從南方醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院采集2600例(男:女=1540:1060,兒童:成人=1446:1154,春:夏:秋:冬=469:500:775:856,市民:農(nóng)民=1466:1134)門診及住院腹瀉病人的糞便樣本(每天大便次數(shù)大于3次,并伴隨性狀改變,如水樣),置于Cary-Blair保存液中送檢(lg糞便+5ml保存液)。所有病人年齡介于3個(gè)月至83歲。兒童定義為18周歲以下,成人則為18周
4、歲以上。耶爾森菌病定義為除相應(yīng)臨床癥狀外還需要從腹瀉糞便中由改良培養(yǎng)方法或RT-PCR檢出致病性Y.e。 初診時(shí)記錄病人的姓名、地址、電話、年齡和基礎(chǔ)疾病等資料,必要時(shí)電話咨詢。對于陽性病人,追蹤記錄其臨床信息,包括大便細(xì)菌檢查、血液細(xì)菌培養(yǎng)和細(xì)菌藥敏試驗(yàn)等。所有記錄均取得病人和主管醫(yī)生的同意。 二、改良培養(yǎng)方法檢測腹瀉糞便 1.糞便的處理:稱取Cary-Blair保存液中糞便0.5g,加入4.5ml生理鹽水中,
5、均勻混合后取500ul至4.5ml增菌液(YSE)中培養(yǎng)。 2.YSE-CIN法:將500ul的糞便混液加入至4.5ml YSE中于16℃培養(yǎng)48小時(shí),然后取5ul接種于CIN平板上于25℃培養(yǎng)24小時(shí)后立即挑取可疑菌落培養(yǎng)(25℃,16小時(shí),腦心淬液),再進(jìn)行初篩試驗(yàn)和生化反應(yīng),同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性對照,以生理鹽水為空白對照。 3.初篩試驗(yàn)和生化試驗(yàn):觸酶(+)試驗(yàn)及尿素酶(+)試驗(yàn)于1小時(shí)內(nèi)出結(jié)果。其余生化試驗(yàn)為動(dòng)
6、力37℃(-)、25℃(+),氧化酶(-),苯丙氨酸(-),V-P(+),甘露醇(+),山梨醇(+),纖維二糖(+),綿子糖(-),蜜二糖(-),鳥氨酸脫羧酶(+),賴氨酸脫羧酶(-),西蒙氏枸椽酸鹽(-),克氏枸椽酸鹽(+)。上述生化試驗(yàn)的反應(yīng)溫度為25℃,結(jié)果符合且七葉苷(25℃)、水楊苷(37℃)均陰性為致病菌,而均陽性為非致病菌。 三、Real-time PCR檢測腹瀉糞便 1.糞便的處理:稱取Cary-Blai
7、r保存液中糞便0.5g,加入4.5ml生理鹽水中,均勻混合后取500ul至4.5ml增菌液(YSE)中培養(yǎng)(16℃18h),再取200ul混合物提取DNA。 2.采用文獻(xiàn)使用的引物和探針并委托公司合成。引物5'-ATCCCAATCACTACTG ACTTC-3'和5'-AATGCTGTCTTCATTTGGAGC-3'(上海生物工程有限公司)及熒光探針FAM5'-CAAGCAAGCTTGTGATCCTCCG-3'BHQ(德國Qia
8、gen公司)。引物和熒光探針合成后用TE緩沖液稀釋為3umol/l和0.4 umol/l,放冰箱避光保存。引物與熒光探針結(jié)合至目的基因(yst,GeneBank X65999),當(dāng)聚合酶延伸遇到探針時(shí),熒光探針被剪切并釋放熒光素FAM,系統(tǒng)因此檢測出一個(gè)目的基因擴(kuò)增從而進(jìn)行定量。該擴(kuò)增產(chǎn)物長度為145bp。 3.反應(yīng)體系:25uL反應(yīng)預(yù)混合液(2×)、引物300nmol/l(5+5ul,3umol/l)、熒光探針40nmol/1
9、(5ul,0.4umol/l)、BSA0.1 ug/ul(5uL,1ug/uL)、模板5ul,總體積50ul。 4.反應(yīng)條件:95℃15min,35循環(huán)×(94℃30s,60℃60s)。每次反應(yīng)都設(shè)立空白對照、陰性對照和陽性對照。本次實(shí)驗(yàn)以反應(yīng)前后的熒光差值作為衡量標(biāo)準(zhǔn),△RQ=RQ+-RQ-。陽性結(jié)果應(yīng)大于4倍空白對照(無模板)或陰性對照(無致病性Y.e)的△RQ值,以便排除其它細(xì)菌。每管反應(yīng)均重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后記錄每個(gè)樣品
10、的熒光值,并取其均數(shù)。 四、大便細(xì)菌檢查、血液細(xì)菌培養(yǎng)和細(xì)菌藥敏試驗(yàn) 陽性病人的大便細(xì)菌檢查送檢驗(yàn)科完成;出現(xiàn)敗血癥的病人需要進(jìn)行血液細(xì)菌培養(yǎng),送檢驗(yàn)科完成;從改良培養(yǎng)方法分離得到的致病性Y.e均進(jìn)行細(xì)菌藥敏試驗(yàn),送檢驗(yàn)科完成。 五、生物分型和血清診斷試驗(yàn) Y.e生物分型參考Bottone和Wauters所制定標(biāo)準(zhǔn)。 所購的診斷血清為Y.e O:3和O:9型,據(jù)說明書介紹不必稀釋,直接使用。取潔
11、凈載玻片一張,吸取已知診斷血清1滴置于載玻片一端,另一端置生理鹽水1滴作為對照。然后取菌液或菌落,分別置血清和生理鹽水中混勻。在1-3min內(nèi),血清滴出現(xiàn)明顯可見的凝集塊,液體變?yōu)橥该?,而鹽水對照滴仍均勻混濁,即為陽性凝集反應(yīng),說明被檢菌與已知診斷血清是相對應(yīng)的。如兩者均混濁則是陰性反應(yīng),如兩者均凝集則為自凝反應(yīng)。按上述操作,以O(shè):3和O:9型Y.e為陽性對照,以大腸桿菌為陰性對照。 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 RT-PCR和改良
12、培養(yǎng)方法檢出率的比較采用McNemer檢驗(yàn),其余統(tǒng)計(jì)分析采用卡方檢驗(yàn),如男女發(fā)病率、季節(jié)發(fā)病率和傳染源構(gòu)成比等??ǚ綑z驗(yàn)和McNemer檢驗(yàn)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理分析。 結(jié)果: 1、腹瀉樣本的檢出結(jié)果和相關(guān)發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)分析 RT-PCR和改良培養(yǎng)方法從2600例樣本中共檢出188例陽性樣本,其中RT-PCR檢出178例,改良培養(yǎng)方法檢出160例。RT-PCR檢出率高于改良培養(yǎng)方法,有顯著性差異(X2
13、=7.61,P=0.005)。若以改良培養(yǎng)方法為金標(biāo)準(zhǔn),RT-PCR的特異性為99.59%,敏感性為93.75%,診斷符合率為98.54%。 在所有腹瀉病人中,Y.e感染率/檢出率為7.23%(188/2600);男女之間發(fā)病率無顯著性差異(X2=0.681,P=0.409),而兒童成人之間(X2=12.766,P=0.000)和市民農(nóng)民之間(X2=11.288,P=0.001)則有顯著性差異。 四個(gè)季節(jié)之間發(fā)病率有顯著
14、性差異(X2=19.676,P=0.000)。其中,春夏與秋冬季節(jié)之間發(fā)病率有顯著性差異(X2=15.409,P=0.000),而秋冬季節(jié)之間則無顯著性差異(X2=3.042,P=0.081)。兒童與成人在4個(gè)季節(jié)的發(fā)病人數(shù)構(gòu)成比無顯著性差異(X2=4.866,P=0.182)。 兒童于3歲以下的發(fā)病率高于3-18歲(11.2% VS6.4%,X2=26.782,P=0.000),而成人于60歲以上的亦高于18-60歲(7.0%
15、 VS3.1%,X2=8.96,P=0.003)。此外,3歲以下兒童(嬰幼兒)和60歲以上成人由于免疫功能相對低下劃分為高危人群。3歲以下兒童的發(fā)病率顯著高于60歲以上的成人(11.2%Vs7.0%,X2=6.820,P=0.009)。 2、致病性Y.e的生物/血清型 從改良培養(yǎng)方法中檢出160株致病性Y.e,包括生物/血清型1A/unknown(4株)、1B/unknown(8)、2/O:9(39)、2/unknown
16、(7)、3/O:3(22)、3/unknown(6)、4/O:3(55)、4/unknown(10)和5/unknown(9)。沒有發(fā)現(xiàn)混合感染的樣本。 3、大便細(xì)菌檢查和血液細(xì)菌培養(yǎng) 4、傳染源 5、臨床表現(xiàn)及并發(fā)癥 6、病人家庭收入分布 7、細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn) 結(jié)論: 1、Real-time PCR檢測糞便中Y.e快速簡便(1.5天),結(jié)果準(zhǔn)確可靠(特異性為99.59%,敏感性為
17、93.75%,診斷符合率為98.54%),因此應(yīng)推廣至臨床檢測和臨床調(diào)查中應(yīng)用。 2、本次研究結(jié)果顯示Y.e在腹瀉患者中的檢出率(7.23%)較以前(0.65%)已經(jīng)顯著上升,即其實(shí)有更多人是由于Y.e引起腹瀉的,所以臨床醫(yī)生確實(shí)需要對Y.e感染的診斷、臨床表現(xiàn)和治療引起重視。也因?yàn)槿绱?,建議Y.e檢測納入大便細(xì)菌檢查或醫(yī)院至少應(yīng)該開展Y.e檢測的項(xiàng)目。 3、耶爾森氏菌病主要表現(xiàn)為胃腸炎、假性闌尾炎和腸道外并發(fā)癥。
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