小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌感染在腹瀉病人中的臨床調(diào)查.pdf

1、背景和目的: 本次實(shí)驗(yàn)研究充分使用改良培養(yǎng)方法和RT-PCR作為檢測手段，兩者優(yōu)劣互補(bǔ)，既可利用RT-PCR在較短時(shí)間內(nèi)提供結(jié)果供臨床醫(yī)生參考，又可利用改良培養(yǎng)方法對RT-PCR結(jié)果進(jìn)行再次驗(yàn)證以及對所分離的致病株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。此外，兩者同時(shí)使用還可以提高檢出率。 目前，在中國或其他一些發(fā)達(dá)國家，由于近年來Y.e的臨床流行病學(xué)資料缺乏以致許多醫(yī)生不了解或較少關(guān)注耶爾森菌病的發(fā)生。此外，培養(yǎng)方法繁瑣費(fèi)時(shí)且檢出率低，所以在以

2、前單純利用培養(yǎng)方法檢測腹瀉糞便中的Y.e會(huì)降低檢出率或發(fā)病率，難以真實(shí)反映客觀情況。因此在這次研究中，我們采集大量（2600例）腹瀉糞便并利用已建立的RT-PCR和改良培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測，目的是：1、初步探討近年Y.e感染在腹瀉病人中的臨床特征，包括發(fā)病率、傳染源、臨床表現(xiàn)、并發(fā)癥、治療和預(yù)后，為醫(yī)生提供有價(jià)值的臨床信息；2、再次驗(yàn)證RT-PCR和改良培養(yǎng)方法的吻合度，為臨床提供快速檢測。 材料和方法: 一、樣本來源和病人

3、信息記錄 于2005年5月至2008年5月從南方醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院采集2600例（男：女=1540：1060，兒童：成人=1446：1154，春：夏：秋：冬=469：500：775：856，市民：農(nóng)民=1466：1134）門診及住院腹瀉病人的糞便樣本（每天大便次數(shù)大于3次，并伴隨性狀改變，如水樣），置于Cary-Blair保存液中送檢（lg糞便+5ml保存液）。所有病人年齡介于3個(gè)月至83歲。兒童定義為18周歲以下，成人則為18周

4、歲以上。耶爾森菌病定義為除相應(yīng)臨床癥狀外還需要從腹瀉糞便中由改良培養(yǎng)方法或RT-PCR檢出致病性Y.e。 初診時(shí)記錄病人的姓名、地址、電話、年齡和基礎(chǔ)疾病等資料，必要時(shí)電話咨詢。對于陽性病人，追蹤記錄其臨床信息，包括大便細(xì)菌檢查、血液細(xì)菌培養(yǎng)和細(xì)菌藥敏試驗(yàn)等。所有記錄均取得病人和主管醫(yī)生的同意。 二、改良培養(yǎng)方法檢測腹瀉糞便 1.糞便的處理：稱取Cary-Blair保存液中糞便0.5g，加入4.5ml生理鹽水中，

5、均勻混合后取500ul至4.5ml增菌液（YSE）中培養(yǎng)。 2.YSE-CIN法：將500ul的糞便混液加入至4.5ml YSE中于16℃培養(yǎng)48小時(shí)，然后取5ul接種于CIN平板上于25℃培養(yǎng)24小時(shí)后立即挑取可疑菌落培養(yǎng)（25℃，16小時(shí)，腦心淬液），再進(jìn)行初篩試驗(yàn)和生化反應(yīng)，同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性對照，以生理鹽水為空白對照。 3.初篩試驗(yàn)和生化試驗(yàn)：觸酶（+）試驗(yàn)及尿素酶（+）試驗(yàn)于1小時(shí)內(nèi)出結(jié)果。其余生化試驗(yàn)為動(dòng)

6、力37℃（-）、25℃（+），氧化酶（-），苯丙氨酸（-），V-P（+），甘露醇（+），山梨醇（+），纖維二糖（+），綿子糖（-），蜜二糖（-），鳥氨酸脫羧酶（+），賴氨酸脫羧酶（-），西蒙氏枸椽酸鹽（-），克氏枸椽酸鹽（+）。上述生化試驗(yàn)的反應(yīng)溫度為25℃，結(jié)果符合且七葉苷（25℃）、水楊苷（37℃）均陰性為致病菌，而均陽性為非致病菌。 三、Real-time PCR檢測腹瀉糞便 1.糞便的處理：稱取Cary-Blai

7、r保存液中糞便0.5g，加入4.5ml生理鹽水中，均勻混合后取500ul至4.5ml增菌液（YSE）中培養(yǎng)（16℃18h），再取200ul混合物提取DNA。 2.采用文獻(xiàn)使用的引物和探針并委托公司合成。引物5'-ATCCCAATCACTACTG ACTTC-3'和5'-AATGCTGTCTTCATTTGGAGC-3'（上海生物工程有限公司）及熒光探針FAM5'-CAAGCAAGCTTGTGATCCTCCG-3'BHQ（德國Qia

8、gen公司）。引物和熒光探針合成后用TE緩沖液稀釋為3umol/l和0.4 umol/l，放冰箱避光保存。引物與熒光探針結(jié)合至目的基因（yst，GeneBank X65999），當(dāng)聚合酶延伸遇到探針時(shí)，熒光探針被剪切并釋放熒光素FAM，系統(tǒng)因此檢測出一個(gè)目的基因擴(kuò)增從而進(jìn)行定量。該擴(kuò)增產(chǎn)物長度為145bp。 3.反應(yīng)體系：25uL反應(yīng)預(yù)混合液（2×）、引物300nmol/l（5+5ul，3umol/l）、熒光探針40nmol/1

9、（5ul，0.4umol/l）、BSA0.1 ug/ul（5uL，1ug/uL）、模板5ul，總體積50ul。 4.反應(yīng)條件：95℃15min，35循環(huán)×（94℃30s，60℃60s）。每次反應(yīng)都設(shè)立空白對照、陰性對照和陽性對照。本次實(shí)驗(yàn)以反應(yīng)前后的熒光差值作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，△RQ=RQ+-RQ-。陽性結(jié)果應(yīng)大于4倍空白對照（無模板）或陰性對照（無致病性Y.e）的△RQ值，以便排除其它細(xì)菌。每管反應(yīng)均重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后記錄每個(gè)樣品

10、的熒光值，并取其均數(shù)。 四、大便細(xì)菌檢查、血液細(xì)菌培養(yǎng)和細(xì)菌藥敏試驗(yàn) 陽性病人的大便細(xì)菌檢查送檢驗(yàn)科完成；出現(xiàn)敗血癥的病人需要進(jìn)行血液細(xì)菌培養(yǎng)，送檢驗(yàn)科完成；從改良培養(yǎng)方法分離得到的致病性Y.e均進(jìn)行細(xì)菌藥敏試驗(yàn)，送檢驗(yàn)科完成。 五、生物分型和血清診斷試驗(yàn) Y.e生物分型參考Bottone和Wauters所制定標(biāo)準(zhǔn)。 所購的診斷血清為Y.e O：3和O：9型，據(jù)說明書介紹不必稀釋，直接使用。取潔

11、凈載玻片一張，吸取已知診斷血清1滴置于載玻片一端，另一端置生理鹽水1滴作為對照。然后取菌液或菌落，分別置血清和生理鹽水中混勻。在1-3min內(nèi)，血清滴出現(xiàn)明顯可見的凝集塊，液體變?yōu)橥该?，而鹽水對照滴仍均勻混濁，即為陽性凝集反應(yīng)，說明被檢菌與已知診斷血清是相對應(yīng)的。如兩者均混濁則是陰性反應(yīng)，如兩者均凝集則為自凝反應(yīng)。按上述操作，以O(shè)：3和O：9型Y.e為陽性對照，以大腸桿菌為陰性對照。 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 RT-PCR和改良

12、培養(yǎng)方法檢出率的比較采用McNemer檢驗(yàn)，其余統(tǒng)計(jì)分析采用卡方檢驗(yàn)，如男女發(fā)病率、季節(jié)發(fā)病率和傳染源構(gòu)成比等?？ǚ綑z驗(yàn)和McNemer檢驗(yàn)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理分析。 結(jié)果: 1、腹瀉樣本的檢出結(jié)果和相關(guān)發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)分析 RT-PCR和改良培養(yǎng)方法從2600例樣本中共檢出188例陽性樣本，其中RT-PCR檢出178例，改良培養(yǎng)方法檢出160例。RT-PCR檢出率高于改良培養(yǎng)方法，有顯著性差異（X2

13、=7.61，P=0.005）。若以改良培養(yǎng)方法為金標(biāo)準(zhǔn)，RT-PCR的特異性為99.59%，敏感性為93.75%，診斷符合率為98.54%。 在所有腹瀉病人中，Y.e感染率/檢出率為7.23%（188/2600）；男女之間發(fā)病率無顯著性差異（X2=0.681，P=0.409），而兒童成人之間（X2=12.766，P=0.000）和市民農(nóng)民之間（X2=11.288，P=0.001）則有顯著性差異。 四個(gè)季節(jié)之間發(fā)病率有顯著

14、性差異（X2=19.676，P=0.000）。其中，春夏與秋冬季節(jié)之間發(fā)病率有顯著性差異（X2=15.409，P=0.000），而秋冬季節(jié)之間則無顯著性差異（X2=3.042，P=0.081）。兒童與成人在4個(gè)季節(jié)的發(fā)病人數(shù)構(gòu)成比無顯著性差異（X2=4.866，P=0.182）。 兒童于3歲以下的發(fā)病率高于3-18歲（11.2% VS6.4%，X2=26.782，P=0.000），而成人于60歲以上的亦高于18-60歲（7.0%

15、 VS3.1%，X2=8.96，P=0.003）。此外，3歲以下兒童（嬰幼兒）和60歲以上成人由于免疫功能相對低下劃分為高危人群。3歲以下兒童的發(fā)病率顯著高于60歲以上的成人（11.2%Vs7.0%，X2=6.820，P=0.009）。 2、致病性Y.e的生物/血清型 從改良培養(yǎng)方法中檢出160株致病性Y.e，包括生物/血清型1A/unknown（4株）、1B/unknown（8）、2/O：9（39）、2/unknown

16、（7）、3/O：3（22）、3/unknown（6）、4/O：3（55）、4/unknown（10）和5/unknown（9）。沒有發(fā)現(xiàn)混合感染的樣本。 3、大便細(xì)菌檢查和血液細(xì)菌培養(yǎng) 4、傳染源 5、臨床表現(xiàn)及并發(fā)癥 6、病人家庭收入分布 7、細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn) 結(jié)論: 1、Real-time PCR檢測糞便中Y.e快速簡便（1.5天），結(jié)果準(zhǔn)確可靠（特異性為99.59%，敏感性為

17、93.75%，診斷符合率為98.54%），因此應(yīng)推廣至臨床檢測和臨床調(diào)查中應(yīng)用。 2、本次研究結(jié)果顯示Y.e在腹瀉患者中的檢出率（7.23%）較以前（0.65%）已經(jīng)顯著上升，即其實(shí)有更多人是由于Y.e引起腹瀉的，所以臨床醫(yī)生確實(shí)需要對Y.e感染的診斷、臨床表現(xiàn)和治療引起重視。也因?yàn)槿绱?，建議Y.e檢測納入大便細(xì)菌檢查或醫(yī)院至少應(yīng)該開展Y.e檢測的項(xiàng)目。 3、耶爾森氏菌病主要表現(xiàn)為胃腸炎、假性闌尾炎和腸道外并發(fā)癥。