腎脾陽虛致衰的機制研究.pdf

1、目的:本研究立足腎脾相關理論,以肌注氫化可的松和灌胃大黃水煎液復制的腎脾陽虛大鼠模型為平臺,觀察模型大鼠的衰老變化,以腎脾陽虛對Klotho蛋白表達的影響為切入點,探討Klotho蛋白及其調控的INS/IGF-1/PI3K/Akt信號轉導通路與腎脾陽虛致衰的相關機制,并觀察桂附理中丸對腎脾陽虛模型大鼠衰老指標的影響。運用現(xiàn)代研究手段檢測其SOD活力、MDA含量,Klotho、Akt、Foxo3a三種基因mRNA及蛋白表達等衰老相關指標,

2、旨在從Klotho蛋白表達調控細胞內的信號轉導通路初步闡明腎脾陽虛致衰老的機理。
　　 方法:本課題采用8周齡SD大鼠40只,雄性,隨機分為正常對照組、模型組、維生素E組和桂附理中丸組四組。除正常對照組外,其余各組大鼠均采用肌注氫化可的松和灌胃大黃水煎液復制腎脾陽虛大鼠模型。正常對照組大鼠每天上午8:00肌肉注射生理鹽水1ml/200g體重,同時灌胃生理鹽水2ml/200g體重,下午14:00灌胃生理鹽水2ml/200g體重;其

3、余組大鼠上午8:00肌肉注射氫化可的松1ml/200g體重(藥物濃度為5mg/ml),同時灌胃大黃水煎液2ml/200g體重(藥物濃度為0.4g/ml),下午14:00模型組灌胃生理鹽水2ml/200g體重,維生素E組灌胃維生素E混懸液2ml/200g體重(藥物濃度為0.0018g/ml),桂附理中丸組灌胃桂附理中丸混懸液2ml/200g體重(藥物濃度為0.162g/ml),共30天。從造模結束次日起,所有實驗大鼠取24小時尿液,腹主動

4、脈采血后,再剝離大腦海馬組織進行相關指標檢測:①檢測24小時尿17-OH-CS及血清睪酮(T)含量;②檢測血清胃泌素、D-木糖含量;③觀察海馬組織的超微結構改變;④檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量;⑤取海馬CA1區(qū)小塊組織制備單細胞懸液,流式細胞儀檢測大腦海馬組織細胞周期,分析各時相區(qū)的百分率以明確細胞老化率;⑥實時熒光定量PCR檢測信號轉導通路(Klotho-INS/IGF-1-PI3K-Akt-FOXO)中

5、Klotho、Akt、Foxo3a三種衰老相關基因的mRNA表達;⑦蛋白免疫印跡及免疫組織化學法染色檢測信號轉導通路(Klotho-INS/IGF-1-PI3K-Akt-FOXO)中Klotho、Akt、Foxo3a三種基因的蛋白表達。
　　 結果:①24小時尿液、血清指標檢測:與正常對照組比較,模型組大鼠尿液17-OH-CS、血清T、胃泌素、D-木糖含量顯著降低(P＜0.01),SOD活力顯著下降(P＜0.01),血清MDA含

6、量顯著上升(P＜0.01);與模型組比較,維生素E組大鼠尿17-OH-CS、血清T、胃泌素、D-木糖含量及SOD活力均明顯升高(P＜0.05),血清MDA含量明顯下降(P＜0.05),桂附理中丸組大鼠血清T、胃泌素、D-木糖含量均顯著升高(P＜0.01),尿17-OH-CS、血清SOD活力明顯升高(P＜0.05),血清MDA含量明顯下降(P＜0.05);與維生素E組比較,桂附理中丸組大鼠尿17-OH-CS、血清T、胃泌素、D-木糖含量明

7、顯升高(P＜0.05),血清SOD活力明顯升高(P＜0.05)。
　　 ②大腦海馬組織指標檢測:與正常對照組比較,模型組大腦海馬細胞器減少,大量脂褐素沉積及海馬神經(jīng)元萎縮、細胞突觸間隙加寬,細胞老化率明顯上升;Klotho調控的細胞信號轉導通路(Klotho-Ins/IGF-1-PI3K-Akt-FOXO)中KlothomRNA表達水平明顯降低(P＜0.05),Foxo3amRNA表達水平明顯升高(P＜0.05),AktmRNA

8、表達水平顯著升高(P＜0.01),Klotho陽性細胞的平均灰度值顯著降低(P＜0.01),P-Foxo3a.陽性細胞的平均灰度值顯著升高(P＜0.01),P-Akt陽性細胞的平均灰度值明顯升高(P＜0.05);與模型組比較,維生素E組及桂附理中丸組大腦海馬細胞器增多,脂褐素沉積減少,較少見到海馬神經(jīng)元萎縮、細胞突觸間隙加寬,細胞老化率明顯下降,維生素E組大鼠KlothomRNA表達水平、平均灰度值明顯升高(P＜0.05),Akt、Fo

9、xo3amRNA表達水平,P-hkt、P-Foxo3a陽性細胞的平均灰度值均明顯降低(P＜0.05),桂附理中丸組大鼠KlothomRNA表達水平明顯升高(P＜0.05),Akt、Fox03amRNA表達水平,P-Akt陽性細胞的平均灰度值均明顯降低(P＜0.05),Klotho陽性細胞的平均灰度值顯著升高(P＜0.01),P-Foxo3a陽性細胞的平均灰度值顯著降低(P＜0.01);與維生素E組比較,桂附理中丸組大腦海馬細胞器增多,很

10、少見到脂褐素沉積減少,海馬神經(jīng)元萎縮、細胞突觸間隙加寬,細胞老化率明顯下降,Klotho陽性細胞的平均灰度值明顯升高(P＜0.05),AktmRNA的表達水平、P-Foxo3a陽性細胞的平均灰度值均明顯降低(P＜＜0.05)。
　　 結論:①采用肌注氫化可的松和灌胃大黃水煎液復合方法復制腎脾陽虛大鼠模型,模型大鼠的一般情況符合腎陽虛、脾陽虛證的診斷標準,且模型大鼠24小時尿17-OH-CS、血清T、血清胃泌素、D-木糖含量均顯著

11、下降,表明腎脾陽虛大鼠模型復制成功。
　　 ②模型組大鼠海馬CA1區(qū)細胞漿內細胞器較少,有大量脂褐素沉積,神經(jīng)元細胞突觸間隙加寬、神經(jīng)元萎縮、水樣變性等現(xiàn)象;血清SOD活力顯著下降、MDA含量明顯升高及細胞老化率上升,表明腎脾陽虛模型大鼠存在衰老變化。
　　 ③溫補腎脾方藥一桂附理中丸可以激發(fā)機體抗衰老基因Klotho表達,促進FOXO的核遷移,直接調控并且上調SOD2的表達,增強抗氧化酶活力,修復機體受損組織器官,從而

12、延緩腎脾陽虛導致衰老的進程。
　　 ④腎脾陽虛模型大腦海馬組織Klotho蛋白表達降低,對INS/IGF-1/PI3K/Akt信號級聯(lián)的抑制減弱,信號轉導通路下游Akt、Foxo3a的磷酸化反應增強,磷酸化Akt、Foxo3a蛋白表達均增多,致使FOXO的核遷移減少,SOD2(MnSOD)的表達下調,超氧化物對機體的損傷增加,從而加速機體衰老。
　　 本研究首次采用肌注氫化可的松和灌胃大黃水煎液復合方法成功復制腎脾陽虛大

13、鼠模型,溫補腎脾方藥——桂附理中丸可以延緩腎脾陽虛導致衰老的進程。腎脾陽虛模型大鼠由于其海馬組織K10tho蛋白表達降低,進而使其下游的INS/IGF-1信號級聯(lián)抑制減弱,信號轉導通路下游Akt、Foxo3a的磷酸化反應增強,磷酸化Akt、Foxo3a蛋白表達增多,FOXO從細胞質移入細胞核減少,SOD2(MnSOD)的表達下調,超氧化物對機體的損害增加,從而加速機體衰老。由此可知,Klotho蛋白低表達是導致腎脾陽虛模型大鼠衰老的可能