STGC3基因低表達(dá)對(duì)NP69細(xì)胞的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：本研究運(yùn)用 shRNA技術(shù)，敲低永生化人鼻咽黏膜上皮NP69細(xì)胞中STGC3基因的表達(dá)，構(gòu)建STGC3穩(wěn)定低表達(dá)NP69細(xì)胞，分析STGC3基因表達(dá)降低對(duì)其生長(zhǎng)、增殖、侵襲、遷移及裸鼠成瘤能力等生物學(xué)行為的影響；應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析STGC3基因低表達(dá)對(duì)NP69細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響，篩選與鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)分子，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)分子的功能，明確STGC3基因在鼻咽黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程可能發(fā)揮的作用及其分子機(jī)制

2、，為全面揭示STGC3基因的功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：根據(jù)堿基序列設(shè)計(jì)靶向干擾STGC3基因的shRNA，構(gòu)建真核表達(dá)干擾載體，應(yīng)用脂質(zhì)體2000將重組質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染NP69細(xì)胞，經(jīng)不同濃度G418篩選，建立STGC3穩(wěn)定低表達(dá)的NP69細(xì)胞系，運(yùn)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)，分析觀(guān)察其生長(zhǎng)、增殖及細(xì)胞周期的變化；同時(shí)分別采用Transwell小室及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，分析探究其遷移、侵襲能力及裸鼠成瘤能力的變化

3、；再運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選、鑒定其差異表達(dá)蛋白質(zhì)分子，分析其生物學(xué)功能；并運(yùn)用IPA（Ingenuity Pathways Analysis）分析差異蛋白質(zhì)分子之間的相互作用。隨后運(yùn)用RT-PCR、Western-Blotting驗(yàn)證部分差異蛋白質(zhì)分子的表達(dá)，并檢測(cè)其在鼻咽癌細(xì)胞及鼻咽癌組織中的表達(dá)；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步干預(yù)差異表達(dá)蛋白質(zhì)分子的功能，研究其對(duì)STGC3基因低表達(dá)NP69細(xì)胞系及鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲與遷移能力的影響，同時(shí)

4、檢測(cè)其相關(guān)信號(hào)通路蛋白質(zhì)分子的表達(dá)。
　　結(jié)果：經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定，確定成功構(gòu)建了STGC3真核表達(dá)干擾載體并命名為pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3。將其與對(duì)照質(zhì)粒pRNAi-U6.1/scramble分別轉(zhuǎn)染NP69細(xì)胞并經(jīng)400μg/ml G418篩選后，熒光顯微鏡下能見(jiàn)到轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3干擾載體轉(zhuǎn)染 NP69細(xì)胞后，STGC3

5、 mRNA水平顯著低于對(duì)照組，表明該干擾載體能成功敲低NP69細(xì)胞中STGC3基因的表達(dá)，穩(wěn)定低表達(dá)STGC3的NP69細(xì)胞（pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞）建立成功。
　　細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)及細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從第4天開(kāi)始，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度明顯快于對(duì)照組；其所形成的細(xì)胞集落數(shù)目明顯多于對(duì)照組，集落體積也大于對(duì)照組（p<0.05），表明STGC3基

6、因低表達(dá)后能促進(jìn)NP69細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，增強(qiáng)其克隆形成能力。FCM分析結(jié)果表明，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞處于（G2+S）期比例明顯高于對(duì)照組(p<0.05)，表明STGC3基因低表達(dá)后能影響細(xì)胞周期進(jìn)程，提高細(xì)胞增殖速度及克隆形成能力。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未包被Matrigel時(shí)，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞其遷移細(xì)胞數(shù)（320.42±28.54）明顯多于pR

7、NAi-U6.1/scramble/NP69細(xì)胞（206.26±15.40）及未轉(zhuǎn)染的NP69細(xì)胞（180.72±16.03）；包被 Matrigel時(shí)，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞其遷移細(xì)胞數(shù)（116.33±3.55）也明顯多于對(duì)照組[分別為（43.00±2.00）、（40.67±2.52）]，差異均有顯著性意義(p<0.05)，表明STGC3基因低表達(dá)后能增強(qiáng)NP69細(xì)胞的遷移、侵襲能力；將pRNAi-

8、U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下，經(jīng)8周飼養(yǎng)并觀(guān)察，但均未見(jiàn)腫瘤的形成。
　　iTRAQ同位素標(biāo)記及質(zhì)譜技術(shù)分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)譜發(fā)生改變，共鑒定出表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì)分子83種，其中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)有45種，包括mTOR、TPM2、Cofilin-1、ANXA3、Musashi-2、Kindlin-2等；表達(dá)

9、下調(diào)的蛋白質(zhì)有38種，包括Beclin-1、TSC-22、AMOTL2等，這些差異蛋白主要參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、蛋白質(zhì)合成、物質(zhì)代謝、細(xì)胞骨架、信號(hào)傳導(dǎo)及自噬等細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程。IPA蛋白質(zhì)相互作用分析軟件表明，這些差異表達(dá)蛋白之間形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，影響pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞的功能。
　　經(jīng)過(guò)RT-PCR、Western-Blotting及免疫組化等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，pRNAi-U6

10、.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞中mTOR表達(dá)增強(qiáng)、Beclin-1表達(dá)降低，證實(shí)了蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信性；同時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在CNE1、CNE2鼻咽癌細(xì)胞及鼻咽癌組織中也存在mTOR表達(dá)增強(qiáng)、Beclin-1表達(dá)降低，且鼻咽癌組織中mTOR蛋白的表達(dá)與Beclin-1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；臨床Ⅲ、Ⅳ期患者及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中mTOR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別高于臨床Ⅱ期患者及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異具有顯著性意義(p<0.05

11、)。
　　應(yīng)用不同濃度(0、1、2、4、8μmol/L)的雷帕霉素處理pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69、CNE1、CNE2細(xì)胞后，雷帕霉素能顯著抑制pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69、CNE2細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，且變化呈濃度依賴(lài)性，而不同濃度雷帕霉素作用不同時(shí)間后均對(duì)CNE1細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用。同一濃度雷帕霉素處理24h后，對(duì)pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69、CNE2細(xì)胞

12、的抑制率低于處理48h和72h的抑制率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而處理48h和72h的抑制率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8μmol/L雷帕霉素處理48h后，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69、CNE2細(xì)胞遷移、侵襲能力均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但雷帕霉素對(duì)CNE1細(xì)胞遷移、侵襲能力無(wú)明顯影響。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，雷帕霉素處理48h后，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC

13、3/NP69細(xì)胞、CNE2細(xì)胞中P-p70S6K和cyclinD1的表達(dá)降低，但mTOR、p70S6K蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化；而8μmol/L雷帕霉素處理48h后，CNE1細(xì)胞中mTOR、p70S6K、P-p70S6K和cyclinD1的表達(dá)較處理前均無(wú)明顯變化；這些結(jié)果表明雷帕霉素能抑制pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69和CNE2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及遷移、侵襲能力，可能與抑制其P-p70S6K和cyclinD1的表達(dá)有關(guān)。