血小板生成素受體激動劑對慢性ITP FcγRs的調控研究.pdf

1、背景:Fcγ受體（Fc gamma receptors，F(xiàn)cγRs）是一種在體內(nèi)多種細胞表面表達的糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族的成員，F(xiàn)cγ受體與IgG的Fc段特異性結合，引發(fā)多種免疫反應，是非常重要的免疫調節(jié)分子，不僅維持機體的正常生理平衡，在免疫損傷、炎癥性疾病和腫瘤的發(fā)病及進展過程中起著非常重要的調節(jié)作用。人類FcγRs分三類，即FcγRⅠ/CD64、FcγPⅡ/CD32和FcγRⅢ/CD16，根據(jù)它們對免疫反應調節(jié)作用的不同又分

2、為活化型受體(FcγRⅠ、FcγRⅡa、FcγRⅢ)和抑制型受體（FcγRⅡb）。FcγRⅠ分布在單核細胞、樹突細胞、巨噬細胞及中性粒細胞表面，是唯一的高親和力Fcγ受體。FcγRⅡ分FcγRⅡa和FcγRⅡb兩種亞型，主要與聚合IgG相結合，具有低到中度親和力，廣泛表達于單核細胞、樹突細胞、自然殺傷細胞(naural killer cell，NK)、中性粒細胞及血小板等。FcγRⅢ結合單體IgG能力較弱，與聚合IgG有低到中度結合力，

3、主要在單核/巨噬細胞、中性粒細胞、NK細胞表面表達。FcγR的胞內(nèi)段包含免疫受體絡氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activating motif,ITAM)和抑制基序(ITIM)，活化型抑或抑制型受體性質取決于此。活化型受體與相應配體IgG-Fc結合，Src家族蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)活化使ITAM磷酸化，引起Syk蛋白募集，激活磷脂酰肌醇3

4、-激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K），產(chǎn)生磷脂酰肌醇3，4，5，-三磷酸(phosphatidylinositol3，4，5-trisphosphate，PIP3)，后者活化酪氨酸蛋白激酶(Bruton tyrosine kinase，BTK)和磷脂酶Cγ(phospholipase Cγ，PLCγ)，產(chǎn)生二酰甘油(diacylglycerol,DAG)和肌醇三磷酸(inositol tripho

5、sphate，IP3)，細胞膜的離子通道開放，鈣離子內(nèi)流，從而引發(fā)一系列免疫細胞活化反應，包括單核/巨噬細胞吞噬作用、抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）及細胞因子、炎癥介質釋放等。FcγRⅡb是Fcγ受體中唯一抑制型受體，免疫復合物與FcγRⅡb結合后，激活胞內(nèi)ITIM信號，引起Src家族酪氨酸激酶去磷酸化，阻止活化信號傳遞，抑制機體免疫

6、反應。另外，F(xiàn)cγRⅡb還可以抑制B細胞增殖、促進B細胞凋亡，從而維持機體免疫耐受。細胞表面往往同時表達活化型和抑制型Fcγ受體，細胞反應結果是兩種受體比值決定的，很多因素可以影響兩種受體的比例，這就可能導致機體免疫反應異常從而引發(fā)自身免疫病。目前大量研究證實，多種自身免疫病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)、類風濕關節(jié)炎(rh

7、eumatoid arthritis，RA)、原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)等都存在FcγR表達失衡，表現(xiàn)在活化型受體FcγRⅠ、FcγRⅡa、FcγRⅢ的表達升高而抑制型受體FcγRⅡb表達降低。活化型和抑制型FcγR的比例失衡在自身免疫病發(fā)生發(fā)展中起至關重要的作用，因此調節(jié)兩種受體平衡是保持免疫耐受和治療自身免疫病的有效途徑。
　　ITP以往稱為特發(fā)性血小板減少

8、性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura)，現(xiàn)根據(jù)本病病因不明、免疫相關及出血表現(xiàn)不一等更名為原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia)，是最常見的出血性疾病，占臨床出血性疾病的1/3。臨床多表現(xiàn)在皮膚黏膜出血、鼻出血、牙齦出血及女性月經(jīng)過多，嚴重時可出現(xiàn)臟器出血、顱內(nèi)出血等致命性出血。出血嚴重程度與血小板數(shù)量呈負相關，另外某些其他因素如年齡、機體狀況、

9、生活環(huán)境等也與出血風險相關。按病程長短ITP分為新診斷、持續(xù)性（3-12個月）和慢性（≥12個月）三大類。研究表明ITP是一種自身免疫病，機體免疫效應細胞過度反應，產(chǎn)生針對血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ的特異性IgG，其與血小板結合后作用于單核細胞表面FcγR，通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)被巨噬細胞吞噬，引起血小板的破壞。目前研究顯示體液和細胞免疫介導的巨核細胞數(shù)量及質量異常所致血小板生成減少也在ITP發(fā)病中起重要作用。另外其他多種免疫失

10、衡如Th1/Th2改變、Th17異常、細胞毒性T細胞直接破壞及T細胞抗原受體(T cell antigen receptor，TCR)基因表達變化等機制均可能參與了ITP的發(fā)病過程，確切發(fā)病機制有待進一步研究證實。
　　目前ITP的治療主要針對阻止血小板過度破壞和促使血小板的生成兩種途徑，包括糖皮質激素、免疫球蛋白、脾切除、利妥昔單抗等免疫抑制治療和促血小板生成素治療，通常ITP對上述治療有效，但容易反復，需要多療程控制，長期治療

11、伴隨骨質疏松、高血壓、免疫低下、嚴重感染等副作用。仍有約1/3患者遷延不愈，成為慢性ITP。
　　ITP是最經(jīng)典的Fcγ受體介導的自身免疫性疾病之一，已有研究證明活化型受體上調和抑制型受體下調是ITP患者發(fā)病的基礎，同時伴隨著ITP治療有效，F(xiàn)cγR平衡趨向恢復。Samuelsson等應用靜脈注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIg)治療小鼠ITP，發(fā)現(xiàn)隨著血小板恢復，小鼠脾巨噬細胞FcγRⅡ

12、b表達上升。Ashi發(fā)現(xiàn)對清除幽門螺桿菌治療有效的ITP患者單核細胞活化型受體FcγRⅠ和FcγRⅡa表達下降而抑制型受體FcγRⅡb表達上升，治療無效患者沒有類似反應，說明清除幽門螺桿菌有利于恢復FcγR平衡從而治療ITP。劉新光等研究了大劑量地塞米松治療ITP患者前后FcγRs的表達，證實地塞米松影響Fcγ受體特別是抑制型FcγRⅡb表達。目前為止沒有關于TPO-RAs對慢性ITP患者FcγRs表達影響的研究報道。
　　目的:

13、檢測慢性ITP患者應用艾曲波帕治療前后外周血單核細胞FcγRⅠ、Ⅱ、Ⅲ分子表達及FcγRⅡa、Ⅱb mRNA水平變化;體外觀察ITP患者治療前后單核細胞吞噬自身血小板的能力變化;檢測ITP小鼠注射羅米司亭前后單核/巨噬細胞FcγRⅠ、Ⅱ、Ⅲ表達變化，探討TPO-RAs對FcγRs系統(tǒng)的調控機制。
　　方法:1.ITP患者治療前后及健康對照外周血的準備:慢性ITP患者21例，健康對照者20例，分別于艾曲波帕服用前、服用6周后抽取外周

14、血，分離單個核細胞和血漿。
　　2.應用流式細胞儀檢測外周血CD14+單核細胞表面FcγRⅠ、Ⅱ、Ⅱb和Ⅲ表達;免疫磁珠分離CD14+單核細胞，實時逆轉錄聚合酶鏈反應(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,real-time RT-PCR)測定FcγRⅡa、Ⅱb mRNA水平;酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent as

15、say,ELISA)檢測ITP患者治療前后和正常對照血漿中轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的水平。
　　結果:1.21位慢性ITP患者經(jīng)艾曲波帕治療6周后，治療有效者占71.43％，其中完全緩解者占28.57％，治療無效者占28.57％。
　　2.流式檢測結果表明:艾曲波帕治療6周后，ITP患者單核細胞FcγRⅠ表達明顯降低，F(xiàn)cγRⅡb表達明顯升高，F(xiàn)cγRⅡ和

16、FcγRⅢ的表達較治療前無顯著變化。在治療有效組中，F(xiàn)cγRⅡb的表達較治療前明顯升高，F(xiàn)cγRⅠ表達明顯降低;治療無效組中，F(xiàn)cγRⅠ、FcγRⅡ和FcγRⅡb的表達治療前后均無顯著性差異;FcγRⅢ的表達在治療有效組及無效組中均無顯著變化。
　　結論:1.血小板生成素受體激動劑(TPO-RAs)艾曲波帕治療慢性ITP反應率高，耐受性好。
　　2.艾曲波帕治療慢性ITP患者6周后，單核細胞活化型受體FcγRⅠ表達下降，抑制

17、型受體FcγRⅡb表達上升，F(xiàn)cγRⅡa/Ⅱb mRNA比值明顯下降。
　　3.艾曲波帕治療有效后，隨著ITP患者單核細胞抑制型受體FcγRⅡb表達回升，單核/巨噬細胞吞噬自身致敏血小板的能力下降。
　　4.艾曲波帕治療有效患者血漿抗炎細胞因子TGF-β1濃度升高，單核細胞FcγRs平衡恢復。
　　5.血小板生成素受體激動劑羅米司亭治療ITP小鼠后，血小板數(shù)值的恢復伴隨單核/巨噬細胞活化型受體FcγRⅠ表達下降和抑制型