上海HIV-1分離株vif基因變異分析及vif蛋白功能的實驗研究.pdf

1、目的:通過本研究對上海HIV-1分離株vif基因及蛋白的結構深入了解;體外重組HIV-1Vif蛋白、制備Vif的鼠多克隆抗體并構建Vif慢病毒載體感染細胞模型為進一步研究利用RNAi技術干擾Vif表達,論證以Vif入手進行HIV-1干預的基因治療可行性。研究方法:利用RT-PCR法體外擴增上海HIV-1分離株vif基因,通過測序并與國際標準HIV-1分離株比較分析上海HIV-1分離株vif基因的突變率,并導出氨基酸變異情況;進一步構建v

2、if基因pET32b(+)原核表達載體,利用BL21 star(DE3)(pLysS)細胞系表達并純化Vif蛋白,以純化的Vif蛋白免疫小鼠制備其鼠多克隆抗體,以ELISA法檢測重組的Vif蛋白及其多克隆抗體的功能;構建HIV-1Vif慢病毒表達載體,感染HEK293T細胞及正常人PBMC細胞,并以Real-Time PCR法和SDS-PAGE檢測vif基因和Vif蛋白的表達。結果:本研究數據證實上海HIV-1分離株vif基因與國際標準

3、HIV毒株比較存在較高突變率,但在150bp～245bp(579bp)之間存在有相對保守的堿基序列,Vif蛋白的氨基酸存在一定的變異規(guī)律,這些氨基酸變異位點是否影響Vif的功能還不十分清楚,有待于進一步研究;本研究重組、表達的HIV-1Vif蛋白,并成功制備了其多克隆抗體,并通過實驗證實AIDS患者血清標本中不存在或僅存在少量的HIV-1 Vif抗體,在HIV-1感染者體內的檢測價值還可以進一步研究:本研究成功構建了表達Vif蛋白的慢病