小鼠再生肝抗GalN-LPS聯(lián)合誘導(dǎo)急性肝損傷的UCP2作用研究.pdf

1、目的：肝臟是人體內(nèi)最為重要的器官之一。臨床上因缺血/再灌注、創(chuàng)傷、腫瘤等原因均可導(dǎo)致肝損傷，如何防治肝損傷和提高肝損傷后的修復(fù)功能，是臨床上亟待解決的難題。已知發(fā)育成熟的動物肝臟在生理條件下，幾乎不進行細胞分裂增殖。但是當(dāng)肝臟受到毒性損害或者外科切除的時候，殘余的肝臟就會顯著再生。再生肝除具有極強的再生能力外，另一個顯著的特點就是具有很強的抗損傷能力。深入認識肝臟的生理特征，揭示再生肝抗損傷的調(diào)控機制，必將為肝臟疾病的預(yù)防和治療提供重要

2、的理論依據(jù)和實施策略。
　　 正常肝臟在做完2/3外科切除后，很短的時間內(nèi)便進入了快速的細胞增殖階段。不同時間點的再生肝對半乳糖胺(galactosamine，GalN)/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等肝損傷毒劑都具有一定的抗損傷能力，但已有實驗證明，96小時的再生肝抗損傷能力最強。雖然半乳糖胺和脂多糖對肝細胞的損傷機制不完全相同，但它們都有一個共同的特點，就是可以使肝細胞內(nèi)活性氧(reactive o

3、xygen species，ROS)的生成增多。大量的活性氧自由基可以介導(dǎo)肝細胞的氧化損傷，參與多種肝臟疾病的病理過程，因此如何有效的對抗肝細胞生成的過多的活性氧自由基便成為提高肝臟抗損傷能力的關(guān)鍵問題。
　　 解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein2，UCP2)是存在于線粒體內(nèi)膜上解偶聯(lián)蛋白家族的新成員之一，廣泛的分布于人類和嚙齒類動物的各個組織和器官中。目前，關(guān)于UCP2的生理功能還不是完全清楚，但已有實驗證明U

4、CP2的解偶聯(lián)效應(yīng)可以使細胞內(nèi)ROS的生成減少，保護細胞免受氧化損傷。已有研究結(jié)果顯示，正常的肝臟實質(zhì)細胞不表達或低表達UCP2，而再生肝細胞中UCP2的表達卻顯著增加，因此我們推測UCP2很可能與再生肝極強的抗損傷能力有關(guān)。為此，本實驗通過運用UCP2特異性體內(nèi)抑制劑京尼平(genipin)來抑制其功能，首先在肝再生動物模型上，檢測給予京尼平抑制的再生肝受到半乳糖胺/脂多糖聯(lián)合誘導(dǎo)損傷后的生化指標，觀察UCP2在抗損傷中的作用；其次，

5、結(jié)合正常張氏肝細胞和UCP2過表達的張氏肝細胞，通過檢測細胞線粒體膜電位和細胞內(nèi)ROS含量的變化以及檢測細胞存活率(MTT)的改變，在離體細胞水平上進一步觀察UCP2在肝細胞抗GalN/LPS聯(lián)合誘導(dǎo)損傷中的作用。
　　 方法：動物實驗選取健康的雄性昆明小鼠，隨機分為6組（n=8/組）：假手術(shù)組(SO)，假手術(shù)損傷組(SO+GalN/LPS)，肝切組(PH)，肝切損傷組(PH+GalN/LPS)，肝切京尼平損傷組（PH+Geni

6、pin+GalN/LPS）和肝切京尼平組(PH+Genipin)。10％水合氯醛腹腔注射麻醉后進行手術(shù)，肝切手術(shù)按Higgins和Anderson方法切除2/3肝組織。假手術(shù)組只打開腹腔，然后縫合，不實施肝切。分別在損傷前12小時和1小時，肝切京尼平損傷組和肝切京尼平組按兩次給予京尼平(20mg/kg/BW，ip)。手術(shù)后96小時，假手術(shù)損傷組，肝切損傷組和肝切京尼平損傷組腹腔注射GalN(400mg/kg/BW)和LPS(10mg/k

7、g/BW)。假手術(shù)組和肝切組只注射相同劑量的生理鹽水。給藥24小時后斷頭取血檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine amiotransferase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平，取肝組織勻漿檢測丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量。另取肝組織制作石蠟切片，HE染色觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變。
　　

8、 本實驗所用細胞為正常張氏肝細胞(Chang Liver)和UCP2過表達的張氏肝細胞。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2恒溫孵育箱培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)2-3代后，待細胞狀態(tài)良好時開始進行實驗。應(yīng)用京尼平作為UCP2特異性抑制劑。將細胞分為四組，分別為對照組、京尼平25μM組、京尼平50μM組、京尼平100μM組。對照組正常換液，給藥組分別給與不同濃度的京尼平作用40min后，用熒光分光光度法檢測細胞線粒體膜電位

9、(mitochondrial membrane potential，MMP)和細胞內(nèi)總ROS的含量。將正常的張氏肝細胞和UCP2過表達的張氏肝細胞分別均勻的種于96孔板中，待基本貼滿板底時，將細胞分為五組，分別為對照組和不同GalN/LPS濃度損傷組。半乳糖胺濃度分別為0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L和2mmol/L，脂多糖濃度為10mg/L。培養(yǎng)12小時后，運用MTT法檢測細胞存活率。
　　 結(jié)果：1．動

10、物死亡率改變
　　 半乳糖胺/脂多糖損傷24小時后，假手術(shù)損傷組死亡率最高，而肝切損傷組抗損傷能力最強，死亡率最低。經(jīng)卡方檢驗統(tǒng)計，肝切損傷組與假手術(shù)損傷組相比，死亡率顯著降低(P＜0.05)；肝切損傷組與肝切京尼平損傷組相比，死亡率降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2．組織形態(tài)學(xué)改變
　　 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組和肝切組細胞形態(tài)正常，中央靜脈周圍肝細胞索排列緊密；但假手術(shù)損傷組肝細胞索排列明顯紊亂，炎性和壞死細

11、胞增多；肝切損傷組多數(shù)肝細胞形態(tài)正常，但局部區(qū)域也有少量炎細胞浸潤和肝細胞壞死；而肝切京尼平損傷組肝細胞索狀排列紊亂，出現(xiàn)較多炎性和壞死細胞；肝切京尼平組肝細胞形態(tài)和肝細胞索排列均比較正常。
　　 3．血清轉(zhuǎn)氨酶水平改變
　　 半乳糖胺/脂多糖損傷24小時后肝細胞內(nèi)大量ALT、AST釋放入血，血清轉(zhuǎn)氨酶水平急劇增高。血清ALT水平：假手術(shù)損傷組約是假手術(shù)組的60倍(P＜0.01)，肝切損傷組約是肝切組的29倍(P＜0.0

12、1)，肝切京尼平損傷組約是肝切損傷組的1.5倍(P＜0.01)；血清AST水平：假手術(shù)損傷組約是假手術(shù)組的24倍(P＜0.01)，肝切損傷組約是肝切組的11倍(P＜0.01)，肝切京尼平損傷組約是肝切損傷組的1.7倍(P＜0.01)。肝切損傷組血清ALT/AST水平明顯低于假手術(shù)肝損傷(P＜0.01)，而肝切損傷組血清ALT/AST也明顯低于肝切京尼平損傷組(P＜0.01)。
　　 4．肝組織MDA和SOD含量改變
　　

13、 肝切組MDA和SOD的含量與假手術(shù)組相比沒有明顯改變。假手術(shù)損傷組與假手術(shù)組相比，MDA含量顯著增加(P＜0.01)，而SOD含量明顯降低(P＜0.05)。肝切損傷組與肝切組相比，MDA含量的增加和SOD含量的降低幅度都小于假手術(shù)損傷組與假手術(shù)組(P＜0.05)。肝切京尼平損傷組與肝切損傷組相比，MDA含量顯著增加(P＜0.01)，而SOD含量卻變化不大。
　　 5．細胞膜電位和ROS水平改變
　　 給與不同濃度京尼平

14、作用40min后，京尼平處理組與對照組相比，肝細胞線粒體膜電位和ROS水平顯著升高(P＜0.01)，且在一定范圍內(nèi)具有劑量依賴性。
　　 6．細胞存活率改變
　　 給與不同濃度的半乳糖胺/脂多糖作用12小時后，UCP2過表達細胞的存活率顯著高于正常肝細胞(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：1．再生肝具有很強的抗損傷能力。運用京尼平特異性抑制UCP2后，再生肝抗損傷能力明顯減弱。結(jié)果提示UCP2是提高再生肝抗GalN/