穴位電針對面神經(jīng)核中神經(jīng)型鈣粘附分子與胎盤型鈣粘附分子表達(dá)的影響.pdf

1、目的:本實驗通過制作面神經(jīng)上頰支壓榨損傷動物模型，以穴位電針作為干預(yù)手段，采用免疫組織化學(xué)SP法和實時熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(Real-time qPCR)研究家兔面神經(jīng)核中N-cad和P-cad的半定量與定量的表達(dá)情況，探討穴位電針對面神經(jīng)受損后面神經(jīng)核中N-cad和P-cad表達(dá)的影響。
　　方法:共選用成年健康的新西蘭家兔104只。其中免疫組織化學(xué)法檢測組，設(shè)立正常對照組、手術(shù)對照組、針刺治療組三個實驗組;正常對照組選

2、新西蘭家兔4只，手術(shù)對照組（24只）、針刺治療組（24只）分別按術(shù)后1天、4天、7天、14天、21天、28天六個時間點，每個時間點選4只，共52只。實時定量PCR法檢測組，也按上述分組方法，選用52只新西蘭家兔。正常對照組不作任何處理，直接取含面神經(jīng)核的腦橋中下部組織進(jìn)行免疫組化和實時定量PCR檢測。手術(shù)對照組、針刺治療組制作右側(cè)面神經(jīng)上頰支壓榨損傷動物模型，損傷程度符合SunderlandⅣ度。術(shù)后兩小時，針刺治療組電針刺激翳風(fēng)、顴繆

3、、頰車、地倉、陽白、四白及合谷穴，每天1次，每次30分鐘;而手術(shù)對照組術(shù)后不做處理。在術(shù)后按六個不同時間點經(jīng)麻醉、經(jīng)心灌注、預(yù)固定等方法取家兔腦橋中下部腦組織，通過固定、漂洗、脫水、包埋制成石蠟切片，然后運用免疫組織化學(xué)SP法檢測面神經(jīng)核運動神經(jīng)元中N-cad和P-cad的蛋白表達(dá)的變化，光鏡下計數(shù)兩種鈣粘附分子標(biāo)記陽性的細(xì)胞數(shù)，應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。Real-time qPCR法檢測組的實驗動物模型制作與免疫組化組相

4、同，模型制作完成后，術(shù)后按六個不同時間點，耳緣靜脈空氣栓塞，在冰臺上取腦橋上緣以下到腦橋下緣3mm以上的腦組織，液氮凍存，-80℃冰箱內(nèi)保存。經(jīng)總RNA提取、PCR引物的制備、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增等步驟，檢測面神經(jīng)核運動神經(jīng)元中粘附分子N-cad和P-cad mRNA的定量表達(dá)情況，應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析電腦輸出目的基因的RQ值。
　　結(jié)果:免疫組織化學(xué)SP法檢測組:正常對照組粘附分子N-cad、P-ca

5、d均無陽性表達(dá)。術(shù)后1天手術(shù)對照組出現(xiàn)了兩種粘附分子標(biāo)記的陽性細(xì)胞(N-cad18.66±4.04、P-cad37.30±3.51)，陽性細(xì)胞DAB染色后呈棕黃色，表達(dá)在面神經(jīng)核運動神經(jīng)元角細(xì)胞胞漿中;針刺治療組同一時間段，兩種分子標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(N-cad48.67±2.08、P-cad61.00±6.00)針刺治療組兩種分子的陽性細(xì)胞數(shù)比手術(shù)對照組高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01);術(shù)后4天手術(shù)對照組兩種分子均有陽性

6、表達(dá)(N-cad21.33±4.51、P-cad42.67±2.52)，針刺治療組(N-cad72.31±8.33、P-cad87.00±4.58)兩種分子的陽性細(xì)胞數(shù)及表達(dá)強度均達(dá)到高峰，針刺治療組與手術(shù)對照組比較，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01);術(shù)后7天手術(shù)對照組(N-cad22.00±4.36、P-cad48.00±1.00)，針刺治療組兩種分子的表達(dá)仍維持在高表達(dá)水平(N-cad68.33±2.08、P-cad84.33

7、±569)，針刺治療組與手術(shù)對照組比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01);術(shù)后第14天，手術(shù)對照組P-cad(54.33±1.53)的陽性表達(dá)達(dá)到最高峰，針刺組兩種分子的陽性表達(dá)有下降趨勢N-cad(53.67±2.52)、P-cad(76.67±6.03)，針灸治療組與手術(shù)對照組比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01);術(shù)后第21天，手術(shù)對照組N-cad無陽性表達(dá)、P-cad(44.00±4.58)，針刺治療組兩種分子均有陽性表

8、達(dá)N-cad(31.33±3.51)、P-cad(69.00±7.94)，針刺治療組與手術(shù)對照組比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01);術(shù)后第28天，手術(shù)對照組N-cad無陽性表達(dá)，P-cad仍有陽性表達(dá)(38.00±8.89)，針刺治療組N-cad無陽性表達(dá)、P-cad有陽性表達(dá)(56.33±3.21)。針灸治療組與手術(shù)對照組比較，N-cad的陽性表達(dá)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，而P-cad的陽性表達(dá)則反之。自術(shù)后21天開

9、始手術(shù)對照組無N-cad陽性表達(dá)，而在術(shù)后第21天仍見針刺組N-cad有陽性表達(dá)。采用Real-time qPCR法獲得兩種分子在不同時間點目的基因的相對表達(dá)量RQ值。正常對照組N-cad基因的RQ值為(1);手術(shù)對照組N-cad基因的RQ值在術(shù)后1天、4天、7天、14天、21天、28天分別為（0.881±0.110）、（1.145±0.202）、（1.164±0.199）、(1.257±0.177)、（1.089±0.189）、（1.

10、065±0.094）;針灸組N-cad基因的RQ值在上述時間點分別為（1.1±0.179）、（1.467±0.218）、（1.495±0.211）、（1.703±0.231）、(1.349±0.169)、（1.267±0.164）。進(jìn)行組間兩兩比較，針刺治療組各時間點的表達(dá)量均比手術(shù)治療組高，統(tǒng)計學(xué)分析具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。正常對照組P-cad基因的RQ值為(1);手術(shù)對照組P-cad基因的RQ值在上述時間點分別為（0.629

11、±0.119）、(1.039±0.249)、（1.223±0.224）、（1.258±0.206）、（1.103±0.286）、（1.097±0.181）;針刺組P-cad基因的RQ值在上述各個時間點分別為(0.775±0.116)、（1.306±0.189）、（1.459±0.233）、（1.748±0.282）、（1.369±0.187）、（1.244±0.167）。進(jìn)行組間兩兩比較，在術(shù)后第1天針刺治療組與手術(shù)對照組比較，無統(tǒng)計學(xué)

12、意義(P=0.062)。針刺治療組在其余時間點的表達(dá)量均比手術(shù)對照組高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.面神經(jīng)損傷的早期即出現(xiàn)兩種分子的陽性表達(dá)，其中P-cad的表達(dá)自術(shù)后一直存在，而N-cad表達(dá)時間相對較短，穴位電刺激能夠促進(jìn)這兩個分子的高表達(dá)，表現(xiàn)在P-cad表達(dá)高峰前移與N-cad持續(xù)時間延長上。2.既往研究表明P-cad不具備促進(jìn)神經(jīng)再生的生物學(xué)功能，而穴位電針刺激其高表達(dá)，說明面神經(jīng)促進(jìn)再生是一個復(fù)雜的