鎘和壬基酚對(duì)鯽魚肝細(xì)胞的毒理作用及聯(lián)合作用的評(píng)價(jià).pdf

1、鎘和壬基酚是常見的兩種環(huán)境污染物，近年來，隨著工業(yè)生產(chǎn)中鎘的使用量增加，及化學(xué)添加劑壬基酚聚氧乙烯醚(壬基酚前體物質(zhì))的廣泛使用，環(huán)境中鎘、壬基酚含量呈上升趨勢(shì)。由于鎘、壬基酚常與許多天然和人工污染同時(shí)進(jìn)入環(huán)境，而引起復(fù)合污染，鎘、壬基酚聯(lián)合暴露給生物健康帶來的一系列危害引起了廣泛關(guān)注。肝臟是急性鎘中毒的靶器官和蓄積部位，壬基酚可誘導(dǎo)魚類肝臟卵黃蛋白原的合成，參與雌性性成熟過程，國內(nèi)外研究者從環(huán)境污染、職業(yè)性暴露及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多方面對(duì)鎘、壬

2、基酚所致肝毒性機(jī)理進(jìn)行了研究，但兩者聯(lián)合毒性的研究則相對(duì)較少，本研究以鯽魚原代培養(yǎng)肝細(xì)胞為模型，較系統(tǒng)的探討了鎘、壬基酚及其聯(lián)合對(duì)鯽魚肝臟的毒性損傷效應(yīng)及作用機(jī)理，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)鎘和壬基酚及其聯(lián)合毒性作用提供理論依據(jù)。
　　 第一部分：無菌分離鯽魚肝臟組織采用酶消化法分離肝細(xì)胞，并使用含有新生牛血清的M199培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)及臺(tái)盼藍(lán)染色法的鑒定，分離的肝細(xì)胞完整，呈圓形，存活率90％以上。說明該方法是較為理想的肝

3、細(xì)胞培養(yǎng)法。在此基礎(chǔ)上增加了：葡萄糖洗必泰對(duì)組織塊的消毒，Percoll分離液對(duì)細(xì)胞的純化，胎牛、新生牛血清對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響等3個(gè)部分的內(nèi)容，發(fā)現(xiàn)使用葡萄糖洗必泰和新生牛血清對(duì)原代肝細(xì)胞培養(yǎng)有利。
　　 第二部分：鎘的肝細(xì)胞毒性研究了鎘誘發(fā)鯽魚肝細(xì)胞相關(guān)的胞內(nèi)游離鈣離子變化，以及Ca2+-ATP酶及金屬硫蛋白表達(dá)量的變化。試驗(yàn)分為對(duì)照組、5、10、15、20μmol/LCdCl25個(gè)組。Ca2+用Fura-2/AM方法檢測(cè)，試驗(yàn)

4、后24h用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子變化；分光光度法檢測(cè)Ca2+-ATP酶；石墨爐-原子分光光度法檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)鎘離子濃度；免疫酶聯(lián)法(ELISA)檢測(cè)了金屬硫蛋白(MT)含量。
　　 結(jié)果顯示，鎘可導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降，具有一定的毒性。鎘離子引起胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度和Ca2+-ATP酶活性增加(P<0.01)。隨鎘濃度升高，處理組Ca2+-ATP酶濃度活性分別是對(duì)照組的6.73、6.68、7.19、6.18倍；暴露24h后

5、各組細(xì)胞內(nèi)鎘離子均有上升，其中5μmol/L組最高，達(dá)2.045±0.322μmol/L；各處理組金屬硫蛋白(MT)含量增高(P<0.01)，且5μmol/L低濃度組MT增幅最大，達(dá)17.15％。結(jié)果提示，鎘誘導(dǎo)下細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，MT表達(dá)量上升，且MT可螯合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鎘離子，這種螯合可能是降低鎘毒理作用的機(jī)制之一。
　　 第三部分：壬基酚的肝細(xì)胞毒性研究了壬基酚誘發(fā)鯽魚肝細(xì)胞相關(guān)的胞內(nèi)游離鈣離子變化，以及Ca2+-ATP酶

6、及金屬硫蛋白表達(dá)量的變化。試驗(yàn)分為對(duì)照組、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/LNP6個(gè)組。Ca2+、Ca2+-ATP酶、MT的檢測(cè)方法同鎘。結(jié)果顯示，壬基酚可抑制肝細(xì)胞增殖，并且高濃度組的細(xì)胞與對(duì)照組相比增殖能力顯著下降，倒置顯微鏡的細(xì)胞形態(tài)觀察顯示，10-3mol/LNP對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。隨著壬基酚濃度的升高，MT表達(dá)量呈現(xiàn)“U”型變化趨勢(shì)，10-7、10-5μmol/L引起MT表

7、達(dá)量的升高(P<0.05，P<0.01)，10-6mol/L組MT表達(dá)量顯著下降(P<0.01)，高濃度組組同對(duì)照組無顯著性差異。根據(jù)細(xì)胞存活率及MT表達(dá)量差異選擇10-6、10-4μmol/L作為受試濃度，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)壬基酚離子引起胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度和Ca2+-ATP酶活性增加(P<0.01)。隨壬基酚濃度升高，處理組Ca2+-ATP酶活性分別是對(duì)照組的分別增加了6.2、4.6倍。結(jié)果提示，壬基酚引發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，是細(xì)胞損傷

8、的機(jī)制之一。
　　 第四部分：鎘和壬基酚的聯(lián)合作用采用3種聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法毒性單位法、相加指數(shù)法、混合毒性指數(shù)法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，得到的結(jié)論一致，鎘和壬基酚在受試范圍內(nèi)均呈協(xié)同作用，毒性從強(qiáng)至弱分別為20μmol/LCd+10-4mol/LNP組、15μmol/LCd+10-4mol/LNP組、20μmol/LCd+10-6mol/LNP組、10μmol/LCd+10-4mol/LNP組、15μmol/LCd+10-6mol/LN

9、P組、5μmol/LCd+10-4mol/LNP組、10μmol/LCd+10-6mol/LNP組、5μmol/LCd+10-6mol/LNP組，、5μmol/LCd+10-6mol/LNP組的協(xié)同作用最強(qiáng)，20μmol/LCd+10-4mol/LNP組最弱。單獨(dú)作用的Cd和10-4mol/LNP沒有抑制MT的表達(dá)，而聯(lián)合作用下出現(xiàn)抑制；聯(lián)合作用時(shí)Ca2+-ATP酶活性與鎘單獨(dú)作用時(shí)相比出現(xiàn)下降。結(jié)論：鎘和壬基酚有協(xié)同作用，MT和Ca2