BNP對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的影響及調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、冠狀動(dòng)脈疾病已經(jīng)成為全世界人口發(fā)病率和病死率主要的原因。在導(dǎo)管室中，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(Percutaneous coronary intervention，PCI)進(jìn)行冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)成為目前最常見和主要的醫(yī)療干預(yù)措施。但是仍然存在著一些大的缺點(diǎn)，如金屬裸支架(Bare metal stents BMS)治療的支架術(shù)后再狹窄(In-stent restenosis，ISR)可以影響到高達(dá)30％至40％的冠狀動(dòng)脈成形術(shù)，藥物洗脫支架(D

2、rug-eluting stents，DES)通過聚合物材料對(duì)附在上面的藥物（如紫杉醇，雷帕霉素等）進(jìn)行洗脫來防止血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖，可以大大降低ISR發(fā)生率至10％以下，也不能完全阻止ISR的發(fā)生，而且會(huì)損傷或延遲內(nèi)皮化從而導(dǎo)致遲發(fā)支架內(nèi)血栓形成，因此支架術(shù)后成功的血管重建要抑制VSMCs增殖和促進(jìn)內(nèi)皮化。
　　 ISR形成的主要原因是由于VSMCs增殖和

3、遷移所引起的新生內(nèi)膜形成。在ISR的過程中，VSMCs在血管壁受損后由分化表型去分化轉(zhuǎn)變?yōu)槿シ只硇停殡S的諸多生長(zhǎng)因子釋放也促進(jìn)VSMCs去分化，從而影響VSMCs的增殖和遷移能力。在內(nèi)膜損傷后，內(nèi)皮細(xì)胞、血小板及炎癥細(xì)胞釋放生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等引起VSMCs由分化表型轉(zhuǎn)變成去分化表型，細(xì)胞外基質(zhì)(Extra cellular matrix，ECM)蛋白沉積，VSMCs由中膜向內(nèi)膜遷移和增殖。VSMCs去分化并重新進(jìn)入細(xì)胞周期，增殖率

4、提高和遷移能力增強(qiáng)，同時(shí)VSMCs收縮蛋白標(biāo)志物表達(dá)下降。VSMCs去分化后，其可遷移至內(nèi)膜下，進(jìn)行增殖和分泌大量的血管外基質(zhì)。去分化的VSMCs在內(nèi)膜中的增殖和遷移被認(rèn)為可導(dǎo)致內(nèi)膜增生的進(jìn)展。血管外基質(zhì)形成大量的內(nèi)膜增生性損傷，可導(dǎo)致血管成形術(shù)后的再狹窄，這被認(rèn)為是血管重建術(shù)失敗的最常見的原因。這種瘢痕組織的生長(zhǎng)是VSMCs增殖和遷移的結(jié)果，直接與支架植入術(shù)后的20％到30％的再狹窄率相關(guān)。
　　 VSMCs表型轉(zhuǎn)變的細(xì)胞內(nèi)調(diào)

5、控機(jī)制并沒有完全闡明，但一些研究表明一些不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了VSMCs表型轉(zhuǎn)變，如PK3K/AKT、Ras/Raf/MEK/ERK1/2及P38MAPK等。Ras/Raf/MEK/ERK1/2信號(hào)途徑參與了凝血酶引起的VSMCs分化。ERK和P38MAPK的激活參與了纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic fibroblast growthfactor， bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor，EGF)使S

6、MC去分化的過程。也有研究認(rèn)為，PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK交叉調(diào)節(jié)的平衡決定了ERK1/2磷酸化情況，從而對(duì)VSMCs表型進(jìn)行調(diào)控。因此，針對(duì)VSMCs表型轉(zhuǎn)換的分子基礎(chǔ)采取相應(yīng)的對(duì)抗措施，降低ISR發(fā)生成為研究熱點(diǎn)。腦利鈉肽(Brain natriuretic peptide，BNP)由心室肌細(xì)胞產(chǎn)生，當(dāng)心室壁受到牽張和舒張末期容積增大時(shí)，其表達(dá)量增加。在從心室肌分泌的過程中，proBNP按1∶1的比例裂解成為含有32個(gè)

7、氨基酸且具有生物活性的BNP。BNP濃度升高可以改善心肌舒張，通過對(duì)抗血管收縮、鈉潴留及激活的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的抗利尿作用，在心室容積急性升高過程中起著非常重要的作用，BNP已經(jīng)被認(rèn)為是心血管疾病尤其是HF的生物標(biāo)志。BNP通過PAR抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生，抑制了VSMCs的增殖，也明顯抑制血清引起的VSMCs增殖，同時(shí)BNP抑制氧化低密度脂蛋白引起的VSMCs遷移。因VSMCs的遷移和增殖能力的改變常伴隨著其表型轉(zhuǎn)

8、變，BNP可能參與了VSMCs的表型轉(zhuǎn)變。
　　 因此，本課題擬以人VSMCs為研究對(duì)象，探討B(tài)NP對(duì)其表型轉(zhuǎn)換的影響以及這種作用是否通過激活P38、ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路完成，并探討PI3K/AKT信號(hào)通路在BNP對(duì)VSMCs表型轉(zhuǎn)變調(diào)控中的作用，為實(shí)現(xiàn)BNP在臨床上應(yīng)用于抗支架術(shù)后再狹窄提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法
　　 1.人主動(dòng)脈VSMCs，在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，2～3d傳代一次，

9、傳至5-7代作為去分化表型VSMCs，利用低血清(1％FBS)培養(yǎng)2-3天的VSMCs作為分化表型VSMCs用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)設(shè)置:分化組(分化表型VSMCs)、去分化組(去分化表型VSMCs)、去分化表型VSMCs+10-8mmol/LBNP組、去分化表型VSMCs+10-7mmol/L BNP組、去分化表型VSMCs+10-6mmol/L BNP組，分別在加入BNP后24h和48h后收集細(xì)胞，進(jìn)行VSMCs的SMα免

10、疫組化染色、SMα及SM-MHC的Western blot檢測(cè)。
　　 3.10-7mmol/L BNP處理去分化VSMCs，在0min、5min、10min及15min行Western blot檢測(cè)P38、ERK及PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)。
　　 4.加入P38及ERK信號(hào)通路阻斷劑SB203580/PD98059，10-7mmol/L BNP處理去分化VSMCs48h后進(jìn)行VSMCs的SMα免疫組化染色、SM

11、α及SM-MHC的Westem blot檢測(cè)。
　　 5.計(jì)量資料數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較用Dunnett及LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.去分化VSMCs的SMα及SM-MHC表達(dá)量較低，而血清饑餓誘導(dǎo)分化VSMCs較去分化VSMCs的SMα

12、及SM-MHC表達(dá)量明顯增加(P＜0.01)。
　　 2.不同濃度的BNP均促進(jìn)去分化VSMCs的SMα及SM-MHC的表達(dá)。10-7mmol/LBNP處理24h及48h的去分化VSMCs的SMα及SM-MHC表達(dá)量均高于去分化VSMCs(P＜0.01)。在24h或48h時(shí)間點(diǎn)，10-7mmol/L BNP處理的去分化VSMCs的SMα及SM-MHC表達(dá)量均高于10-8mmol/L和10-6mmol/L BNP處理的去分化VSM

13、Cs的SMα及SM-MHC表達(dá)量。10-7mmol/L BNP處理48h的去分化VSMCs的SMα及SM-MHC表達(dá)量高于10-7mmol/L BNP處理24h的去分化VSMCs的SMα及SM-MHC表達(dá)量(P＜0.05)。
　　 3.10-7mmol/L BNP處理去分化VSMCs，P-AKT表達(dá)略有降低，但各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); P-P38在5min及10min時(shí)表達(dá)增加(P＜0.01），而10min時(shí)

14、的表達(dá)量高于5min時(shí)的表達(dá)量（P＜0.05），15min時(shí)的表達(dá)量接近于0min的表達(dá)量;P-ERK表達(dá)逐漸增加，在5min及10min時(shí)間點(diǎn)上最明顯，而10min時(shí)的表達(dá)量高于5min時(shí)的表達(dá)量(ERK1(∶)P＜0.05;ERK2(∶)P＜0.01)。
　　 4.P38抑制劑SB203580、ERK抑制劑PD98059對(duì)BNP誘導(dǎo)的去分化VSMCs的分化均有明顯的抑制作用，加入阻斷劑的BNP組VSMCs的SMα及SM-MH