TRADD調(diào)控RIP1非依賴的細(xì)胞程序性壞死及RIP3非依賴的細(xì)胞凋亡研究.pdf

1、細(xì)胞程序性壞死(programmed necrosis，necroptosis)是近年來鑒定的一種新的細(xì)胞程序性死亡方式，在炎癥反應(yīng)、外源微生物入侵防御和胚胎發(fā)育等病理和生理過程中都發(fā)揮著重要調(diào)控作用。多種因素都能夠誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死，其中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha，TNFα)誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死目前研究的最為廣泛。TNFα是一種多功能的細(xì)胞因子，與細(xì)胞膜上的受體(TNFα receptor1，

2、TNFR1)結(jié)合后促進(jìn) TNFR1胞內(nèi)段構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而招募并結(jié)合具有死亡結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，如 TRADD(TNF receptor1 associated death domain)和RIP1(receptor-interacting protein1)，形成復(fù)合體I（complex I），進(jìn)而招募其他蛋白激酶，活化NFκB或MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞生存和增殖。RIP1與TNFR1解離后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，招募并結(jié)合RIP3(recept

3、or-interacting protein3)，形成”壞死復(fù)合體(necrosome)”，且兩者通過相互磷酸化或在其他蛋白的影響下磷酸化而激活，進(jìn)而招募并結(jié)合 RIP3的底物蛋白 MLKL(mixed lineage kinase domain like pseudokinase)，促進(jìn) MLKL的磷酸化與多聚化，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上與磷脂酰肌醇相結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死。
　　RIP1是首個(gè)鑒定的細(xì)胞程序性壞死調(diào)

4、控蛋白，其別構(gòu)抑制劑Necrostatin-1在細(xì)胞和疾病模型中都能顯著抑制細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生。同時(shí)，敲低RIP1也能顯著抑制TNFα與Z-VAD聯(lián)合誘導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryo fibroblast，MEF)、3T3(過表達(dá)RIP3)和HT29等細(xì)胞的程序性壞死，表明RIP1是啟動(dòng)細(xì)胞程序性壞死的必不可少的靶蛋白。但是，近期研究發(fā)現(xiàn)敲低L929細(xì)胞內(nèi)的RIP1，并不抑制TNFα單獨(dú)或與Z-VAD聯(lián)合誘導(dǎo)的細(xì)胞死

5、亡，且這一現(xiàn)象在MEF細(xì)胞中得到進(jìn)一步驗(yàn)證，表明在敲低RIP1的L929或MEF細(xì)胞中TNFα可以通過其他機(jī)制來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，但這種細(xì)胞死亡的類型、調(diào)控靶點(diǎn)與機(jī)制目前并不清楚。
　　本研究以L929細(xì)胞為模型，利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干涉技術(shù)構(gòu)建了穩(wěn)定敲低RIP1及其他靶蛋白的L929細(xì)胞株，探索了TNFα誘導(dǎo)RIP1非依賴性細(xì)胞死亡的調(diào)控靶點(diǎn)與機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)RIP1敲低并不抑制TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，且細(xì)胞凋亡抑制劑Z-VAD-F

6、MK及caspase8敲低對(duì)細(xì)胞死亡過程中沒有抑制作用，表明RIP1非依賴的細(xì)胞死亡不是凋亡，而是程序性壞死。同時(shí)，TNFα在誘導(dǎo)RIP1非依賴的細(xì)胞程序性壞死促進(jìn)RIP3及其底物蛋白MLKL的磷酸化和多聚化，且敲低RIP3或 MLKL能夠阻斷 RIP1非依賴的細(xì)胞程序性壞死，表明 TNFα通過活化RIP3/MLKL信號(hào)通路來誘導(dǎo)RIP1非依賴的細(xì)胞程序性壞死。RIP1可以通過結(jié)合TNFR1與RIP3來形成不同的蛋白復(fù)合體，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞

7、程序性壞死信號(hào)從TNFR1傳遞到RIP3，但目前并無RIP3與TNFR1直接結(jié)合的相關(guān)報(bào)道，因此，在敲低RIP1的細(xì)胞中TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死信號(hào)如何從TNFR1傳遞到RIP3目前并不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)RIP1敲低促進(jìn)RIP3與TNFR1的結(jié)合，以及RIP3與TRADD的相互結(jié)合，但TRADD敲低則阻斷RIP3與TNFR1結(jié)合形成的蛋白復(fù)合體，表明TRADD能夠介導(dǎo)RIP3與TNFR1的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞程序性壞死信號(hào)的傳遞。同時(shí)，

8、我們發(fā)現(xiàn)敲低TRADD能夠完全抑制TNFα誘導(dǎo)的RIP1非依賴的細(xì)胞程序性壞死，以及RIP3/MLKL信號(hào)通路的活化，表明TRADD通過介導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死信號(hào)的傳遞來啟動(dòng)TNFα誘導(dǎo)的RIP1非依賴的細(xì)胞程序性壞死。此外，我們發(fā)現(xiàn)敲低RIP3能抑制TNFα與Z-VAD聯(lián)合誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，但并不阻斷TNFα單獨(dú)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，表明RIP3敲低可導(dǎo)致TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡方式由程序性壞死轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞凋亡。同時(shí)，在RIP3非依賴的細(xì)胞死亡過程中

9、檢測到caspase信號(hào)通路的活化，且敲低caspase8能完全阻斷RIP3非依賴的細(xì)胞死亡，進(jìn)一步驗(yàn)證了RIP3非依賴的細(xì)胞死亡是細(xì)胞凋亡。由于敲低TRADD能夠顯著抑制RIP3非依賴的細(xì)胞凋亡，且TRADD在細(xì)胞凋亡過程中能結(jié)合caspase8并促進(jìn)其活化，進(jìn)而激活caspase信號(hào)通路，表明TRADD也是調(diào)控RIP3非依賴的細(xì)胞凋亡的重要靶點(diǎn)，并通過活化caspase信號(hào)通路來啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。因此，本研究發(fā)現(xiàn)TRADD是RIP1非依