RA-FLS的遷移、侵襲及RA相關(guān)miRNAs表達(dá)水平的檢測.pdf

1、目的：
　　比較類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞(RA-FLS)與正常關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞遷移、侵襲能力，并檢測RA相關(guān)miRNAs在兩種細(xì)胞中表達(dá)水平的改變，為進(jìn)一步研究miRNAs在RA發(fā)病中的作用及尋找RA治療新的靶點(diǎn)提供實(shí)驗依據(jù)。
　　對象：
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞和正常人關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞
　　方法：
　　選擇類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞的細(xì)胞MH7A和正常人關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)

2、胞HFLS用于實(shí)驗研究。MH7A和HFLS細(xì)胞生長至匯合度80％左右時進(jìn)行細(xì)胞傳代，三代至六代細(xì)胞用于實(shí)驗研究。臺盼藍(lán)染色實(shí)驗鑒定細(xì)胞活性。利用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗和Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗檢測并比較兩種細(xì)胞的遷移、侵襲能力。Trizol法分別提取兩組細(xì)胞的總RNA，并進(jìn)行RNA定量分析。按照SYBR(R) PrimeScriptTM miRNA RT-PCRKit（Takara，RR716）說明書進(jìn)行Poly(A)加尾

3、反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄成cDNA。選定用于實(shí)驗的miRNAs和內(nèi)參，查找miRNAs數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org)，分別找到選定miRNAs的原始序列，并按照引物設(shè)計原則進(jìn)行引物設(shè)計，合成擴(kuò)增miRNAs的引物。進(jìn)行實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)，并對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　培養(yǎng)的HFLS呈長梭形、多角形，具有突起，細(xì)胞胞體較大，邊界不清晰，大小不均勻，MH7A為長梭形，

4、排列規(guī)則。臺盼藍(lán)染色實(shí)驗顯示兩種細(xì)胞的活細(xì)胞率均大于90％，符合實(shí)驗要求。Transwell細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗顯示MH7A遷移、侵襲能力較HFLS明顯增強(qiáng)。選定相關(guān)的11種miRNAs用于實(shí)驗，分別為miR-132、-155、-203、-223、-124、-15a、-16、18a、-19a、-26a、-146a，RT-qPCR檢測miRNAs在兩種細(xì)胞中的表達(dá)，與HFLS相比，MH7A細(xì)胞中miR-132、-155、-203、-223、

5、-124的表達(dá)上調(diào)，其相對表達(dá)量升高，分別為2.328倍、3.882倍、6.020倍、1.343倍和1.831倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中miR-203表達(dá)升高最為顯著;而miR-15a、-16、18a、-19a、-26a、-146a的表達(dá)下調(diào)，其相對表達(dá)量降低，分別為0.625倍、0.367倍、0.742倍、0.602倍、0.533倍和0.424倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中miR-16表達(dá)降低最為顯著。