張力敏感性陽離子通道在氣道黏液基礎分泌中的介導作用.pdf

1、目的：探討張力敏感性陽離子通道對氣道黏蛋白(MUC)基礎性分泌的調(diào)節(jié)作用，進一步完善氣道黏液分泌發(fā)生機制的理論，為了解氣道黏液基礎性分泌的生理和病理狀態(tài)提供理論依據(jù)。
　　方法：采用氣/液相界面法培養(yǎng)人氣道上皮16HBE細胞，參考文獻后改裝裝置模擬正常呼吸，按照正常呼吸節(jié)律作用于培養(yǎng)細胞，檢測反映氣道上皮黏液層穩(wěn)態(tài)的一系列重要指標。實驗分組：(1)靜態(tài)對照組：無節(jié)律性壓力波刺激，僅培養(yǎng)液培養(yǎng)16HBE細胞；(2)節(jié)律性壓力波組：啟

2、動上述裝置模擬正常呼吸產(chǎn)生的壓力波作用于16HBE細胞；(3)節(jié)律性壓力波+張力敏感性陽離子通道拮抗劑釕紅(RR)組：先于16HBE細胞中加入RR預處理，再模擬正常呼吸產(chǎn)生的壓力波組用于16HBE細胞；(4)節(jié)律性壓力波+維拉帕米：先加入鈣通道抑制劑維拉帕米預處理，模擬正常呼吸產(chǎn)生的壓力波組用于16HBE細胞；(5)節(jié)律性壓力波+蛋白激酶C抑制劑(GF109203x)：先加入PKC抑制劑預處理，再節(jié)律性壓力波作用于細胞。MTT法測定五組

3、16HBE細胞生長活性；分組培養(yǎng)48h后，用ELISA檢測各組MUC(2、5AC和5B)蛋白的分泌水平；RT-PCR檢測各組TRPV4及MUC5AC的mRNA水平；Western blot法檢測各組MARCKS及SNAP-23蛋白水平的表達；在細胞免疫化學激光共聚焦顯微鏡下，觀察各組16HBE細胞中MUC2蛋白表達的情況及細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。
　　結(jié)果：(1)5組16HBE細胞的生存率分別為(93.9±3.1)％、(99.2

4、±4.3)％、(94.6±7.3)％、(96.6±2.3)％和(96.5±5.0)％。靜態(tài)對照組較節(jié)律性壓力波刺激的組別的細胞生存率減低。(2)節(jié)律性壓力波組內(nèi)MUC(2、5AC和5B)蛋白含量明顯高于靜態(tài)對照組(P<0.01)；RR處理組和維拉帕米、PKC抑制劑后的MUC(2、5AC和5B)蛋白表達水平較壓力波組明顯降低(P<0.01)。(3)在節(jié)律性壓力波作用后SNAP-23、pSNAP-23及MARCKS、pMARCKS的蛋白表達

5、水平為1.08％0.48、0.84+0.40、1.15±0.35、0.34±0.56均顯著高于對照組(P<0.01)；同時可觀察到給予釕紅，鈣通道阻滯劑維拉帕米以及GF109203x預處理后，pMARCKS及pSNAP-23蛋白表達明顯降低(P<0.01)。(4)在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到，靜態(tài)對照組相比較壓力波做的MUC2蛋白熒光強度明顯升高，給予RR、維拉帕米及GF109203x預處理后，MUC2胞質(zhì)內(nèi)熒光明顯減弱。(5)PCR結(jié)

6、果亦提示壓力波作用后的TRPV4 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于靜態(tài)對照組(P<0.01)；預先給予RR、維拉帕米及GF109203x處理后，TRPV4的轉(zhuǎn)錄水平有所下降，RR組較明顯，但其水平仍高于對照組(P<0.01)
　　結(jié)論：1.人氣道正常呼吸產(chǎn)生的節(jié)律性壓力波參與維持氣道微環(huán)境中基礎性MUC分泌平衡。
　　2.節(jié)律性壓力波對氣道黏蛋白分泌的影響是通過激活TRPV4蛋白通道，其主要的機制是通過Ca2+/PKC/MARCK