新型分子信標(biāo)的合成及其性能研究.pdf

1、上世紀(jì)80年代，基于經(jīng)典的固相合成技術(shù)演化而來(lái)的DNA 自動(dòng)合成儀的誕生，突破了DNA 化學(xué)合成的瓶頸，使得人們可以相當(dāng)自由地設(shè)計(jì)各種類(lèi)型的核酸分子探針，廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。但在后基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)代，人們不斷對(duì)核酸分子探針在靈敏度、穩(wěn)定性、分子識(shí)別與信號(hào)轉(zhuǎn)換方式等多方面提出更高的要求，以發(fā)展新的分子生物學(xué)研究方法，這使得核酸分子探針的設(shè)計(jì)合成顯得更為重要。本論文通過(guò)搭建核酸合成平臺(tái)，開(kāi)展了新型分子信標(biāo)核酸分子探針的合成

2、與性能研究，主要包括了以下三個(gè)方面的工作：
　　 (1)核酸合成平臺(tái)的搭建基于DNA 合成儀和液相色譜技術(shù)，合成純化了普通DNA 引物(cDNA)、常規(guī)分子信標(biāo)(DNA-MB)以及超淬滅分子信標(biāo)(SQ-MB)，利用基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行了分析，結(jié)果表明所得到的純化產(chǎn)物均為目標(biāo)分子。與cDNA 雜交的結(jié)果表明，超淬滅分子信標(biāo)的信背比達(dá)到40 倍，比常規(guī)分子信標(biāo)高出4 倍。說(shuō)明我們已經(jīng)

3、掌握了普通DNA 引物以及染料標(biāo)記的DNA 探針的合成與純化技術(shù)。
　　 (2)鎖核酸分子信標(biāo)的合成與性能考察為了實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)mRNA的監(jiān)測(cè)，需要雜交速度快、靈敏度高、抗酶切能力強(qiáng)、選擇性好的核酸分子探針。我們合成了一種莖部具有三對(duì)配對(duì)堿基的鎖核酸分子信標(biāo)(LNA-MB)，其與cDNA 雜交反應(yīng)速度快，5分鐘即可達(dá)到平衡。
　　 與常規(guī)分子信標(biāo)相比，該鎖核酸分子信標(biāo)抗酶切能力顯著增強(qiáng)，熱穩(wěn)定性有了明顯提高。
　　

4、 (3)鎖核酸分子信標(biāo)與共臂cDNA 雜交性能的考察有研究工作表明分子信標(biāo)與共臂cDNA (s hared-stem cDNA)雜交能夠提高其靈敏度。因此我們考察了鎖核酸分子信標(biāo)與共臂cDNA的雜交性能。結(jié)果表明：與cDNA 相比，共臂cDNA與鎖核酸分子信標(biāo)雜交的靈敏度更高，信背比達(dá)到200 倍，線性范圍為20 pmol·L-1-20 nmol·L-1，檢測(cè)限為9.8 pmol·L-1，且具有較好的選擇性，雜交反應(yīng)前20 s 內(nèi)的熒光