人甲狀旁腺素（1-34）及血清白蛋白與人甲狀旁腺素（1-34）融合蛋白的表達、純化與鑒定.pdf

1、本研究為解決進一步進行PTH(1-34)口服或吸入等劑型的研究中的大量蛋白原料來源問題，運用基因工程技術(shù)，構(gòu)建能夠高效表達PTH(1-34)肽的重組大腸桿菌。實驗選擇了原核表達系統(tǒng)，通過純化、酶切后，獲得氨基端無其他氨基酸殘基的重組PTH(1-34)肽，為今后開發(fā)PTH(1-34)肽的非注射途徑給藥研究奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。其次，為了延長PTH(1-34)在體內(nèi)作用的半衰期，本研究中還設(shè)計了一種PTH(1-34)與人血清白蛋白(human

2、serumalbumin，HSA)的融合蛋白。作為血漿的重要成分之一，HSA是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體，正常情況下不易透過腎小球。在血漿中的半衰期長達2周，體內(nèi)分布極廣而且沒有酶學和免疫學活性，因而是一種理想的生物活性蛋白載體。通過基因工程技術(shù)改造了PTH(1-34)多肽分子，期望使其在不喪失受激活受體及刺激骨重建的功能的情況下，血漿中的半衰期能夠得到顯著地延長。這樣HSA-PTH(1-34)融合蛋白就會降低給藥頻率和劑量卻發(fā)揮出與

3、PTH相似的藥效作用。利用基因工程方法，構(gòu)建能夠高效表達HSA-PTH(1-34)融合蛋白的重組畢赤酵母工程菌，為進一步研究治療骨質(zhì)疏松的PTH(1-34)長效制劑奠定基礎(chǔ)。 1.重組表達PTH(1-34)的大腸桿菌的構(gòu)建及鑒定1.1重組pGEX-4T-PTH(1-34)表達質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)人PTH的氨基酸序列，按大腸桿菌偏愛的密碼子推斷設(shè)計其PTH(1-34)的DNA序列，5'端添加BamHI酶切位點和腸激酶識別序列，3'端添

4、加TAA終止密碼子及EcoRI酶切位點，全序列合成后插入pUC19載體中。擴增后收獲質(zhì)粒，雙酶切獲取目的基因片段，插入經(jīng)相應(yīng)雙內(nèi)切酶酶切后的原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞。DNA測序證實PTH(1-34)基因已經(jīng)按預(yù)計的方案正確的插入原核表達載體pGEX-4T-1。1.2重組菌的誘導(dǎo)表達及目標蛋白的可溶性分析攜有pGEX-4T-PTH(1-34)表達質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)鑒

5、定正確后，在2×YT培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)3h，再經(jīng)0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)7h后，收獲菌體。SDS-PAGE可見GST-PTH(1-34)融合蛋白的分子量約為30kDa符合預(yù)計值。超聲破菌后取上清及沉淀進行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)可溶形式的目標蛋白占菌體總蛋白的40﹪左右。 1.3融合蛋白的純化利用融合蛋白的GST標簽，采用親和層析法純化融合蛋白GST-PTH(1-34)。超聲破菌離心后取上清用GlutathioneSeph

6、arose4B瓊脂糖珠進行親和純化，用競爭性洗脫液-還原型谷胱甘肽溶液洗脫。融合蛋白的純度經(jīng)過SDS-PAGE和光密度掃描分析，其純度在92.5﹪。經(jīng)過蛋白質(zhì)定量，每升發(fā)酵液中的菌體可收獲約0.5g的融合蛋白。 1.4融合蛋白的免疫印跡分析Westernblotting結(jié)果顯示融合蛋白GST-PTH(1-34)能與羊抗PTH(1-34)多抗發(fā)生特異性結(jié)合。這表明PTH(1-34)基因正確插入表達載體中，未出現(xiàn)移碼。

7、1.5融合蛋白的腸激酶酶切加工純化后的融合蛋白GST-PTH(1-34)經(jīng)過腸激酶20℃酶切過夜，酶切液用截留分子量為10000的超濾管高速離心收集PTH(1-34)。取酶切后的產(chǎn)物及超濾產(chǎn)物，進行SDS-PAGE分析。PTH(1-34)的產(chǎn)量約為每升發(fā)酵液中菌體可收獲30mg,純度達90﹪。 1.6PTH(1-34)的分子量及一級結(jié)構(gòu)的鑒定PTH(1-34)肽經(jīng)納升級電噴霧質(zhì)譜(nanoESI-MS)鑒定其分子量為4115.

8、21，和理論值相差0.06﹪。對其進行ESI-MS/MS分析，測定胰蛋白酶酶切后四條肽段的序列和數(shù)據(jù)庫查尋進行結(jié)構(gòu)鑒定，驗證了重組蛋白質(zhì)PTH(1-34)一級結(jié)構(gòu)與理論值一致，在表達純化的過程中沒有氨基酸的丟失和突變。 1.7PTH(1-34)的生物學活性鑒定采用經(jīng)典的腺苷酸環(huán)化酶活性檢測法確定重組PTH(1-34)的生物學活性。制作新鮮的兔腎皮細胞膜作為酶源，用CyclicAMPEIAKit來定量由于腺苷酸環(huán)化酶激活產(chǎn)生的c

9、AMP的量。測活結(jié)果表明本研究重組的PTH(1-34)具有良好的腺苷酸環(huán)化酶激活能力，腺苷酸環(huán)化酶的表觀活性為2104pmolcAMP/mgprotein·30min。 2.重組表達HSA-PTH(1-34)的畢赤酵母的構(gòu)建鑒定 2.1pPIC9-HSA-PTH(1-34)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定從人肝提取mRNA，經(jīng)RT-PCR法獲得血清白蛋白的全長基因，長度大約為1.8kb，TA連接將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體

10、中，測序驗證基因序列與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中的HSA的NM000477序列完全一致。設(shè)計含有柔性連接肽GlyGlyGlyGlySer的引物，從全合成PTH(1-34)基因中PCR法獲得含有連接肽的PTH(1-34)基因。在原核宿主DH5α中成功地將人血清白蛋白基因的5'端通過柔性接頭(GGGGS)與PTH(1-34)的3'端相連接，并克隆至pPIC9載體中。用PstI酶切鑒定重組質(zhì)粒，證明已成功構(gòu)建。 2.2畢赤酵母

11、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子甲醇利用表型鑒定用氯化鋰法制作畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，將用StuI線性化的pPIC9-HSA-PTH(1-34)轉(zhuǎn)化至GS115中。轉(zhuǎn)化后鋪于不含組氨酸的RDB平板，30℃培養(yǎng)2天后長出約30個畢赤酵母轉(zhuǎn)化子。點種至MM板和MD板進行甲醇利用表型篩選，其中Mut+型轉(zhuǎn)化子約占總轉(zhuǎn)化子的90﹪，Mut-型轉(zhuǎn)化子約占總轉(zhuǎn)化子的10﹪。 2.3畢赤酵母轉(zhuǎn)化子PCR法鑒定以重組酵母的基因組為模板，用αfactor-u

12、p和AOX1-down為引物進行PCR檢測，電泳在1900bp處有一明顯條帶。結(jié)果顯示HSA-PTH(1-34)表達盒已經(jīng)成功的整合至酵母基因組中。 2.4畢赤酵母轉(zhuǎn)化子搖瓶誘導(dǎo)表達隨機挑選的幾個畢赤酵母轉(zhuǎn)化子在搖瓶里30℃、以250r/min轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)，經(jīng)0.5﹪甲醇誘導(dǎo)表達120h，電泳鑒定在70kDa處都出現(xiàn)了目標條帶。選取4號轉(zhuǎn)化子進行發(fā)酵培養(yǎng)，取誘導(dǎo)培養(yǎng)的24h、48h、72h、120h培養(yǎng)液樣品，離心取上清進行S

13、DS-PAGE分析。電泳鑒定發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時間的延長，培養(yǎng)基中的分泌蛋白的量增多。運用免疫比濁法進行測定誘導(dǎo)96h發(fā)酵液中HSA-PTH(1-34)融合蛋白的濃度約為400mg/L。 2.5Westernblotting免疫印跡分析免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)凝膠電泳中的70kDa條帶既能與羊抗HSA抗血清，也能與羊抗PTH(1-34)多克隆抗體之間的發(fā)生特異性結(jié)合。免疫印跡的結(jié)果驗證了的融合蛋白的HSA和PTH(1-34)兩個結(jié)構(gòu)域的存在

14、，融合蛋白同時具有HSA和PTH(1-34)抗原性。 2.6HSA-PTH(1-34)融合蛋白的純化取搖瓶中誘導(dǎo)表達96h的發(fā)酵培養(yǎng)基脫色，硫酸銨沉淀，脫鹽處理后，得到粗純化的融合蛋白HSA-PTH(1-34)。光密度掃描電泳結(jié)果顯示其純度達90﹪。 2.7HSA-PTH(1-34)融合蛋白的PMF鑒定將融合蛋白經(jīng)過胰蛋白酶酶切后，用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀對酶解肽段做PMF分析。Mascot數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果表明

15、融合蛋白中HSA結(jié)構(gòu)域的存在。 2.8HSA-PTH(1-34)的生物學活性鑒定采用經(jīng)典的腺苷酸環(huán)化酶刺激活性檢測法確定HSA-PTH(1-34)的生物學活性。測活結(jié)果表明本研究重組的HSA-PTH(1-34)具有腺苷酸環(huán)化酶激活能力，腺苷酸環(huán)化酶的表觀活性為1403pmolcAMP/mgprotein·30min。 綜上所述：1.本實驗采用基因工程的方法，在大腸桿菌中將PTH(1-34)肽與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GS

16、T)融合表達并采用腸激酶酶切加工的方法獲得了氨基端無任何其他氨基酸殘基的PTH(1-34)肽。不僅獲得較高的表達量，提供了一種快速純化PTH(1-34)肽的方法，而且避免了化學合成所造成的毒性以及小肽單獨表達不利于檢測、純化的缺點。通過對重組PTH(1-34)的免疫學活性，生物學活性，分子量及一級結(jié)構(gòu)的測定，證明已經(jīng)成功構(gòu)建可表達有活性的PTH(1-34)的高產(chǎn)工程菌。完全適合進一步擴大生產(chǎn)，為PTH(1-34)非注射途徑給藥研究打下良

17、好基礎(chǔ)。 實驗中采用先進的納升級電噴霧質(zhì)譜技術(shù)(nanoESI-MS)和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(MS/MS)對重組多肽進行了分子量和全序列分析，具有準確、靈敏、快速的特點，為獲得表達多肽更全面的質(zhì)量控制信息提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。 2.經(jīng)過westernblotting，腺苷酸環(huán)化酶刺激等實驗驗證了我們在畢赤酵母中成功的高表達出有生物學活性的HSA-PTH(1-34)融合蛋白，將會很大程度地延長PTH(1-34)在體內(nèi)作用的半衰