Identification of Novel Nematicidal Crystal Proteins and Host--Pathogen Interactions in Bacillus Thuringiensis.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一種昆蟲病原菌，其特征是在形成芽胞的同時會產(chǎn)生由Cry蛋白組成的伴胞晶體，這些伴胞晶體對多種農(nóng)業(yè)害蟲具有毒殺活性。因此，Bt成為用于微生物農(nóng)藥最成功的微生物，此外，Bt的Cry蛋白基因也可以通過轉(zhuǎn)基因作物的方式應(yīng)用于農(nóng)業(yè)上重要昆蟲的防治。目前關(guān)于Bt Cry蛋白防治昆蟲的研究相對較多，然而對于Cry蛋白防治線蟲的研究還很有限。植物寄生線蟲對農(nóng)作物造成重大的損失，因此需

2、要尋找對線蟲具有較高毒性和較廣譜的新型Cry蛋白?；诖?，本研究集中于分離新菌株并使用基因組分析的方法來發(fā)掘新型Cry蛋白基因的工作。主要研究內(nèi)容如下:
　　1)通過100個Bt基因組分析發(fā)現(xiàn)在20％的Bt基因組中存在cry基因片段化的現(xiàn)象，通過對其中一個片段化基因cry5B-LN的功能研究發(fā)現(xiàn)該片段化基因與另一Cry蛋白Cry5Ba的C端編碼序列融合表達時，可以形成典型的伴胞晶體，同時該融合晶體蛋白可以造成線蟲腸道上皮細胞連接的

3、破壞，進而表現(xiàn)出對線蟲具有毒殺活性，本研究結(jié)果揭示了片段化的cry基因可以作為潛在的具有活性的毒素資源。
　　晶體蛋白典型的N端domain在毒素的活性及特異性上具有重要的角色功能，而C端domain幫助3D晶體結(jié)構(gòu)的形成。然而在大規(guī)模Bt基因組測序中發(fā)現(xiàn)某些片段化的Cry蛋白基因多是N端或者C端的現(xiàn)象。在本研究的第一部分，我們篩選了100個Bt基因組以調(diào)查這些片段化cry基因的發(fā)生。通過信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)除了65個完整的cry基因之

4、外，還有20個基因組中含有N端或C端的片段化基因。為了進一步研究片段化基因的表達和功能，本研究以一個片段化基因為例，該基因來自于具有殺線蟲活性的Bt菌株C15的基因組，其編碼序列覆蓋了殺線蟲晶體蛋白Cry5Ba N端的47％，且相似性為28％。因此將該片段化基因命名為cry5B-likeN端基因(cry5B-LN)。我們首先利用傳統(tǒng)的Bt表達系統(tǒng)來表達cry5B-LN，發(fā)現(xiàn)該基因片段無法表達。然而，當將該片段與Cry5Ba的C端編碼序列

5、融合表達時，不僅可以表達晶體蛋白，還可以形成伴胞晶體，電子顯微鏡照片顯示融合成的晶體為雙棱錐形狀。通過秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）的生測實驗發(fā)現(xiàn)該N+C融合晶體蛋白對線蟲具有明顯活性，其半致死濃度LC50為23.7μg/ml，能夠縮短線蟲的壽命，同時影響線蟲發(fā)育。通過鏡檢觀察融合蛋白處理后線蟲的病理學(xué)變化發(fā)現(xiàn)該融合蛋白能夠造成線蟲腸道的損傷，從而確定了該融合蛋白的作用部位。通過熒光顯微鏡觀察融合蛋白處理后

6、GFP標記的線蟲突變體FT63的表型變化發(fā)現(xiàn)該融合蛋白可以造成線蟲腸道上皮細胞連接的破壞，從而確定了該融合蛋白的作用方式。以上結(jié)果表明這些片段化的Cry蛋白基因可能是毒性較高的新型Cry蛋白的來源。本研究對片段化基因的進一步研究不僅有助于新型Cry蛋白基因資源的發(fā)掘，同時也有助于更好地研究Bt產(chǎn)生多結(jié)構(gòu)域毒素的進化策略。
　　2)通過Bt基因組分析發(fā)現(xiàn)了一個新型Cry蛋白Cry5Fa，該蛋白與已報道對線蟲具有活性的Cry5Ba具有

7、一定相似性，但通過對該蛋白的活性檢測發(fā)現(xiàn)Cry5Fa對具有Cry5Ba抗性的線蟲突變體有毒殺活性，暗示了Cry5Fa是一種廣譜的具有殺線蟲活性的新型晶體蛋白。
　　本研究通過對Bt菌株F-14的基因組分析發(fā)現(xiàn)了一個潛在的新型Cry蛋白，其保守結(jié)構(gòu)域與Cry5Ba具有一定的相似性，將其命名為Cry5Fa。序列分析表明,Cry5Fa的C端與Cry5Ba的C端的相似度更高，達到70％～80％，而Cry5Fa的N端與Cry5Ba的N端的相

8、似度只有20％～30％，兩個蛋白全長的相似度為58％。通過傳統(tǒng)的Bt表達系統(tǒng)在Bt無晶體突變株BMB171中表達cry5Fa基因，發(fā)現(xiàn)該基因可以表達，并產(chǎn)生菱形晶體。通過對秀麗隱桿線蟲及其糖脂突變體的生測實驗發(fā)現(xiàn)Cry5Fa對秀麗隱桿線蟲糖脂突變體（該突變體對Cry5Ba具有抗性）具有毒性，半致死濃度LC50為31μg/mL。該結(jié)果說明Cry5Fa作用于線蟲的作用機制可能與Cry5Ba不一樣。
　　3)通過信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Bt中存在

9、Aerolysin類毒素Hydralysin，通過對該蛋白的活性檢測發(fā)現(xiàn)單獨的Hydralysin對線蟲具有較低的活性，但與Cry5Ba復(fù)配時可以顯著提高Cry5Ba的毒性，說明了Bt中的Hydralysin可以作為毒力因子協(xié)同增強Cry蛋白的毒性。
　　除了Cry蛋白之外，Bt還會產(chǎn)生大量的毒力因子參與殺蟲的過程。這些毒力因子可以根據(jù)其序列和特異性進行分類。本研究發(fā)現(xiàn)了一個基因(750bp)編碼32.5kDa的蛋白，通過序列分析