桑白皮抗MRSA活性成分研究.pdf

1、目的：
　　 1.篩選?？粕僦参锷０灼?Morus albaL.)的抗臨床耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)等病原菌的有效部位，明確活性單體成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　 2.測(cè)定桑白皮中活性單體化合物對(duì)MRSA等病原菌的抗菌活性強(qiáng)度，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討其作用方式，測(cè)定活性單體化合物與常用抗菌素聯(lián)合抗MRSA作用的方式。
　　

2、3.研究部分活性單體化合物對(duì)人肝細(xì)胞株HL-7702和肺癌細(xì)胞株A549的細(xì)胞毒性。
　　 方法：
　　 1.以生物活性導(dǎo)向分離(bioactivity-guided fractionation)的方法，即結(jié)合細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)，采用溶劑萃取、柱色譜分離和測(cè)定抑菌圈等方法，篩選桑白皮中具有抗MRSA活性的部位并跟蹤篩選活性部位的色譜分段產(chǎn)物，對(duì)高活性的色譜片段進(jìn)一步分離純化得到活性單體化合物，結(jié)合現(xiàn)代波譜分析技術(shù)和理化方

3、法鑒定其結(jié)構(gòu)。
　　 2.對(duì)分離得到的活性單體化合物進(jìn)行系統(tǒng)的抗MRSA等病原菌活性的研究；采用微量稀釋法測(cè)定其直接作用的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。根掘測(cè)定結(jié)果，采用紙片擴(kuò)散法(Disk diffusion method)篩選與單體化合物有聯(lián)合抗菌作用的抗菌劑，進(jìn)一步采用微量棋盤稀釋法(Checkboard microdilution method)和時(shí)間-殺菌曲線法(Time-killing curve)

4、評(píng)價(jià)化合物與所篩選出的抗菌劑的聯(lián)合作用方式。
　　 3.采用MTS[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium]法，通過(guò)測(cè)定吸光度(OD)值來(lái)評(píng)價(jià)化合物對(duì)人肝細(xì)胞株HL-7702和肺癌細(xì)胞株A549的細(xì)胞毒性活性。
　　 結(jié)果：
　　 1.從桑白皮提取物的乙酸乙酯活性部位中分離得到

5、11個(gè)活性單體化合物，經(jīng)理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)為：Cyclocommunol(化合物1)、Multicaulisin(化合物2)、SanggenonG(化合物3)、Moursinol(化合物4)、Morusin(化合物5)、AlbanolA(MulberrofuranG)(化合物6)、β-谷甾醇(化合物7)、MoracinM(化合物8)、AlbaninG(KuwanonH)(化合物9)、(E)-oxyresveraterol(

6、化合物10)、KuwanonE(化合物11)。
　　 2.微量稀釋法結(jié)果顯示，化合物1、2、3、9、11對(duì)MRSA作用最強(qiáng)，其MIC范圍為2～16μg/mL，MBC范圍為8～128μg/mL；化合物5、6、8、10對(duì)MRSA作用次之，其MIC范圍為8～128μg/mL，MBC范圍為32～256μg/mL；化合物4、7的抗MRSA活性最弱，其MIC值均≥512μg/mL，MBC值大于1024μg/mL。
　　 3.受試單體

7、化合物與臨床常用抗菌劑聯(lián)合作用方式考察的結(jié)果顯示：(1)紙片擴(kuò)散法篩選出來(lái)的抗菌劑主要為氨基糖苷類、喹諾酮類及糖肽類。(2)微量稀釋棋盤法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：化合物1與慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、萬(wàn)古霉素等聯(lián)合用藥的FICI在0.375～1.062之間，多數(shù)表現(xiàn)為相加或無(wú)關(guān)作用；化合物2與慶大霉素、阿米卡星及依替米星聯(lián)合抗MRSA的FICI范圍為0.25～1，表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用；化合物3與阿米卡星、依替米星聯(lián)合作用的FICI范圍為0.3

8、75～0.75，表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用；化合物4與阿米卡星、鏈霉素、環(huán)丙沙星、萬(wàn)古霉素及替考拉寧聯(lián)合的FICI范圍為0.094～0.75，表現(xiàn)為協(xié)同、相加作用；化合物5與阿米卡星、依替米星聯(lián)合作用FICI范圍為0.188～1，表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用；化合物8與慶大霉素、依替米星聯(lián)合應(yīng)用FICI范圍為0.25～0.75，表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用；化合物9與阿米卡星、左氧氟沙星聯(lián)合作用FICI范圍為0.188～1.5，表現(xiàn)為協(xié)同、相加或無(wú)關(guān)作用；化

9、合物11與依替米星、阿米卡星聯(lián)合作用FICI范圍為0.259～1，表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用。(3)時(shí)間殺菌曲線法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：化合物1、2、5與抗菌素在24h時(shí)單用與聯(lián)用相比，其log10CFU/mL降低值均在0～1之間，表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用；化合物3與阿米卡星聯(lián)合時(shí)其log10CFU/mL降低值大于2，表現(xiàn)為協(xié)同作用，與依替米星聯(lián)合時(shí)△log10CFU/mL在1～2之間，表現(xiàn)為相加作用；化合物4、8與抗菌素聯(lián)用的△log10CFU/mL在0～2

10、之間，表現(xiàn)為相加或無(wú)關(guān)作用；化合物9與阿米卡星及左氧氟沙星聯(lián)合的△log10CFU/mL均大于2，表現(xiàn)為協(xié)同作用。
　　 4.桑白皮單體化合物1～4的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：化合物2和3對(duì)A549以及HL-7702的IC50值范圍在3～4.4μg/mL之間；化合物1和4對(duì)A549以及HL-7702的IC50值范圍在27.4～260μg/mL之間。
　　 結(jié)論：
　　 通過(guò)對(duì)桑白皮提取物體外抗MRSA活性的追蹤篩選，從其