熒光脂質(zhì)體技術(shù)研究天然產(chǎn)物的生物膜通透性.pdf

1、天然產(chǎn)物是一類非常重要的藥學活性成分，2001-2005年間，有23種治療細菌、真菌感染、癌癥、糖尿病、高血脂、皮炎、Alzheimer's癥等疾病的天然產(chǎn)物藥物面世。從天然產(chǎn)物中分離單體并衍生化是獲得新藥的重要手段之一。全世界每年有數(shù)以千計新的單體從天然產(chǎn)物中分離出來，又有更大量的衍生物被合成出來。要從浩如煙海的天然產(chǎn)物中選出適合的先導藥物，快速準確的高通量篩選至關(guān)重要。
　　 常規(guī)的篩選方法，如動物篩選法、細胞篩選法、受體篩

2、選法、酶篩選法等實驗周期較長、對實驗設(shè)備有較高要求，應用于天然產(chǎn)物的快速、高通量篩選有一定的局限性。
　　 本文構(gòu)建了一種高通量篩選天然產(chǎn)物的熒光脂質(zhì)體模型。模型篩選原理如下：藥物的生物膜通透性與其活性密切相關(guān)，用脂質(zhì)體模擬生物膜，通過測定藥物對包封在脂質(zhì)體內(nèi)的熒光探針的熒光淬滅來評價藥物的生物膜通透性，根據(jù)藥物生物膜通透性的大小來篩選藥物。
　　 本文主要進行了以下幾方面的研究工作：
　　 1.建立了適用于評價

3、天然產(chǎn)物生物膜通透性的熒光脂質(zhì)體模型從研究藥物在生物膜中的通透性角度進行藥物活性成分的篩選，是近年來藥物篩選研究的新熱點。本課題從天然產(chǎn)物被動擴散進入生物膜能力的角度，構(gòu)建了具有創(chuàng)新意義的天然產(chǎn)物生物膜通透性測定模型。我們建立了能夠模擬生物膜的熒光脂質(zhì)體，用以評價天然產(chǎn)物的生物膜通透性，具體包括：
　　 (1)選用三種合適的熒光試劑，DPH、TMA-DPH和NBD，分別位于脂質(zhì)體的脂雙層內(nèi)部、中部和最外部。當藥物進入脂質(zhì)體的不同

4、部位時會使位于該部位的熒光探針熒光強度變化，由此評價天然產(chǎn)物的生物膜通透性。
　　 (2)使用多種材料制備脂質(zhì)體，從脂質(zhì)體電位、粒徑、熒光強度、數(shù)據(jù)重現(xiàn)性等方面考察脂質(zhì)體穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)DSPG能增強脂質(zhì)體穩(wěn)定性，而膽固醇對脂質(zhì)體的穩(wěn)定性沒有貢獻，最終確定了熒光脂質(zhì)體的最佳組成為DSPG：PC0.1:1(mol/mol)。所制備的熒光脂質(zhì)體穩(wěn)定性好、熒光試劑不易泄漏、試驗數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好。
　　 2.測定了多種天然產(chǎn)物對熒光脂質(zhì)

5、體模型的熒光影響(1)考察了天然產(chǎn)物與熒光脂質(zhì)體的作用時間，發(fā)現(xiàn)兩者混勻10 min后熒光強度穩(wěn)定，因此在以后的實驗中選擇10 min為反應時間?？疾炝?μM、4μM、8μM、12μM、16μM濃度的藥物對脂質(zhì)體熒光的影響，發(fā)現(xiàn)4μM藥物對脂質(zhì)體熒光有顯著影響，熒光靈敏度較高、信號較穩(wěn)定，所消耗樣品量少，確定4μM為最佳藥物濃度。
　　 (2)選用了35種結(jié)構(gòu)不同、藥理活性不同的天然產(chǎn)物，測定它們對熒光脂質(zhì)體熒光的影響。親脂性好

6、的藥物對脂質(zhì)體熒光淬滅較大，親水性好的藥物對脂質(zhì)體熒光淬滅較小。
　　 (3)測定天然產(chǎn)物對熒光脂質(zhì)體熒光偏振度的影響，發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物會導致脂質(zhì)體的熒光偏振度上升，脂質(zhì)體膜流動性減小，并且隨著天然產(chǎn)物濃度的增加膜流動性逐漸減小，說明天然產(chǎn)物進入了脂質(zhì)體膜相中，降低了膜相的流動性。
　　 (4)測定天然產(chǎn)物對游離熒光探針DPH-TMA、NBD的影響，發(fā)現(xiàn)要極高濃度的天然產(chǎn)物才能使游離的熒光探針產(chǎn)生熒光淬滅，說明天然產(chǎn)物對熒光

7、脂質(zhì)體的熒光淬滅是由于天然產(chǎn)物進入了脂質(zhì)體中，在熒光探針附近富集到了較高濃度而產(chǎn)生的。
　　 (5)考察了藥物對CF脂質(zhì)體熒光的影響，結(jié)果藥物對CF脂質(zhì)體的熒光沒有明顯改變，表明藥物沒有破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。
　　 3.測定了多種天然產(chǎn)物對熒光紅細胞膜的熒光影響(1)用熒光探針DPH和DPH-TMA標記大鼠紅細胞膜，得到熒光紅細胞膜。
　　 (2)測定天然產(chǎn)物對熒光紅細胞膜的熒光影響，親脂性好的天然產(chǎn)物對紅細胞膜熒光淬

8、滅較大，親水性好的天然產(chǎn)物對紅細胞膜熒光淬滅較小。
　　 (3)比較天然產(chǎn)物對脂質(zhì)體和紅細胞膜熒光的影響，發(fā)現(xiàn)兩者有較好的相關(guān)性，對脂質(zhì)體熒光淬滅大的天然產(chǎn)物對紅細胞膜的熒光淬滅也較大，對脂質(zhì)體熒光淬滅小的天然產(chǎn)物對紅細胞膜的熒光淬滅也較小。在2μM-16μM的濃度范圍內(nèi)，天然產(chǎn)物對脂質(zhì)體與紅細胞膜的熒光淬滅百分率成線性相關(guān)，相關(guān)性良好。表明脂質(zhì)體模型可以在一定程度上替代細胞膜，研究天然產(chǎn)物對生物膜的通透性。
　　 4.

9、測定了多種天然產(chǎn)物的Caco-2細胞表觀滲透系數(shù)和大鼠小腸吸收系數(shù)(1)測定多種天然產(chǎn)物的Caco-2細胞表觀滲透系數(shù)Papp，Papp與天然產(chǎn)物對紅細胞膜和脂質(zhì)體的熒光淬滅百分率線性相關(guān)，相關(guān)性都較好。
　　 (2)測定多種天然產(chǎn)物的大鼠小腸有效吸收系數(shù)Peff，Peff與天然產(chǎn)物對紅細胞膜和脂質(zhì)體的熒光淬滅百分率線性相關(guān)，相關(guān)性都較好。
　　 被動吸收是多數(shù)藥物的主要吸收方式，被動吸收與藥物的生物膜通透性相關(guān)，因此藥

10、物的吸收與其生物膜通透性相關(guān)。熒光脂質(zhì)體模型可以評價藥物的生物膜通透性，理論上也可以評價藥物的吸收程度。實驗證明，熒光紅細胞膜與熒光脂質(zhì)體模型與藥物吸收相關(guān)性良好，表明熒光仿生膜可以評價天然產(chǎn)物的吸收。
　　 5.測定了多種天然產(chǎn)物與白蛋白的結(jié)合程度以及結(jié)合機理(1)血清白蛋白與藥物結(jié)合后血液中游離藥物會減少，到達靶部位發(fā)揮藥效的藥物量會相應減少，我們首次用熒光脂質(zhì)體模型來研究藥物與白蛋白的結(jié)合程度，研究靶細胞與白蛋白對天然產(chǎn)物

11、的競爭結(jié)合。
　　 (2)蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)具有重要生理功能的大分子，是藥物發(fā)揮藥效的重要載體和靶分子，我們用熒光法初步研究了天然產(chǎn)物與白蛋白作用的一些機理，對于了解藥物發(fā)揮藥效的作用機制，揭示藥物藥效的實質(zhì)內(nèi)涵具有重要意義。結(jié)果實驗中所用的天然產(chǎn)物通過疏水作用力、靜電引力或氫鍵、范德華力等結(jié)合力自發(fā)與白蛋白結(jié)合，靜態(tài)淬滅白蛋白內(nèi)源性熒光。
　　 綜合而言，熒光脂質(zhì)體模型操作簡便、對實驗條件要求不高，可以在實驗室中推廣使用