苯并[α]芘對(duì)櫛孔扇貝生殖內(nèi)分泌干擾機(jī)制的研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,簡(jiǎn)稱 PAHs)屬于持久性有毒化學(xué)污染物（Persistent Toxic Substances, PTS），包括很多具有致癌、致畸、致突變能力的物質(zhì)，其中苯并[α]芘（benzo[α]pyrene, B[α]P）是致癌性最強(qiáng)的一種，而且眾多研究還表明其具有內(nèi)分泌干擾特性。目前對(duì)B[α]P的內(nèi)分泌干擾性研究多集中在哺乳動(dòng)物或者魚類動(dòng)物中，對(duì)無脊椎動(dòng)物的內(nèi)分泌干擾

2、效應(yīng)研究在國(guó)內(nèi)外都很少。本論文研究了B[α]P對(duì)櫛孔扇貝性腺和血淋巴中的性激素水平、卵巢中類固醇合成代謝酶和相關(guān)核受體調(diào)節(jié)基因的表達(dá),性腺DNA斷裂、過氧化損傷以及性腺顯微結(jié)構(gòu)的影響，探討了B[α]P對(duì)櫛孔扇貝的生殖內(nèi)分泌干擾機(jī)制和生殖毒性機(jī)制，得到了如下結(jié)果：
　　1、苯并[α]芘對(duì)櫛孔扇貝性腺和血淋巴中性激素水平的影響
　　本實(shí)驗(yàn)將櫛孔扇貝曝污于不同濃度（0.025μg/L、0.5μg/L、10μg/L）的B[α]P染毒

3、10d，分別于3d和10d取樣，使用電化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定了櫛孔扇貝精巢和卵巢中睪酮和雌二醇含量的變化。結(jié)果表明，在3d和10d時(shí)B[α]P能夠顯著干擾各處理組櫛孔扇貝性腺中孕酮含量的正常波動(dòng)，并在10d時(shí)顯著降低了各染毒組組櫛孔扇貝性腺中睪酮和雌二醇的含量。在10d時(shí)對(duì)櫛孔扇貝血淋巴中的性激素含量也有一定的影響，但是這種影響要比在性腺中的小。B[α]P對(duì)性激素水平的干擾作用對(duì)雄性櫛孔扇貝造成的影響稍大于對(duì)雌性個(gè)體的影響，表現(xiàn)在相比于雌性

4、個(gè)體同濃度的B[α]P暴露對(duì)雄性個(gè)體的性激素水平的影響更顯著或者變化幅度更大。本實(shí)驗(yàn)表明，B[α]P能夠通過干擾各櫛孔扇貝性腺中孕酮含量、降低櫛孔扇貝性腺中睪酮和雌二醇的含量而發(fā)揮內(nèi)分泌干擾作用，且B[α]P對(duì)雄性個(gè)體的影響能力高于對(duì)雌性個(gè)體的影響能力。
　　2、苯并芘對(duì)櫛孔扇貝生殖相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　本論文利用RT-PCR以及RACE技術(shù)成功克隆了櫛孔扇貝CYP3A的完整cDNA序列。Cf CYP3A cDNA序列全長(zhǎng)

5、為2110bp，其中5'和3'非編碼區(qū)（UTR）分別為105bp和427bp。開放閱讀框ORF為1578bp，編碼525個(gè)氨基酸殘基同源性分析表明櫛孔扇貝CYP3A與囊舌蟲CYP3A13-like、cyp3a90-like和紫海膽CYP3A8-like的相似性分別為42％、40%和40%，因此將其歸入CYP3A家族。在脊椎動(dòng)物中CYP3A與機(jī)體代謝多種外源污染物和性激素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)將櫛孔扇貝曝污于不同濃度（0.025μg/L、0.5μg

6、/L、10μg/L）的B[α]P染毒10d，分別于3d和10d取樣，通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)B[α]P對(duì)生殖相關(guān)基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間的B[α]P暴露（10d）會(huì)對(duì)櫛孔扇貝卵巢內(nèi)類固醇合成酶3β-HSD, CYP17和17β-HSD的基因表達(dá)造成劑量依賴性的降低，這與前人的研究結(jié)果相一致。因?yàn)樽髡哒J(rèn)為3β-HSD，CYP17和17β-HSD可能是B[α]P干擾櫛孔扇貝卵巢內(nèi)類固醇激素合成機(jī)制的靶基因。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，低濃度的0

7、.025μg/L B[α]P上調(diào)了AhR、ARNT、CYP1A1、CYP3A、ER和Vg基因的表達(dá)，表明其不僅誘導(dǎo)了代謝外源物質(zhì)的AhR途徑的轉(zhuǎn)錄活性增加，而且在機(jī)體內(nèi)代謝產(chǎn)生了雌激素效應(yīng)，但是高濃度10μg/L的B[α]P會(huì)抑制上述基因的表達(dá)。作者推測(cè)這可能是因?yàn)樵谳^長(zhǎng)時(shí)間高濃度的B[α]P暴露造成的毒性超過了機(jī)體所能調(diào)節(jié)的范圍，導(dǎo)致無法正常應(yīng)對(duì)外源污染物對(duì)解毒代謝基因的誘導(dǎo)，AhR通路不能被正常激活，而代謝外源污染物質(zhì)的CYP1A1

8、和CYP3A基因也不能被誘導(dǎo)表達(dá)。這種超越機(jī)體調(diào)節(jié)能力的污染程度可能會(huì)使機(jī)體的解毒防御系統(tǒng)面臨崩潰，最終對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的傷害。低濃度B[α]P暴露下ER-Vg基因表達(dá)的升高可能是通過AhR/ARNT通路介導(dǎo)的CYP1A1的活性增加而引起的，而10μg/L的B[α]P會(huì)抑制R-Vg基因的表達(dá)可能是因?yàn)殡S染毒濃度升高，機(jī)體內(nèi)B[α]P的代謝及毒性增強(qiáng)，對(duì)ER信號(hào)通路的阻礙性干擾效應(yīng)增加，最終抑制了ER與Vg基因的表達(dá)，也可能是高濃度B[α]

9、P會(huì)造成睪酮和雌二醇含量的大幅降低，性激素缺乏導(dǎo)致了ER與Vg基因的表達(dá)降低。
　　3、B[α]P對(duì)櫛孔扇貝性腺損傷效應(yīng)的研究
　　本實(shí)驗(yàn)將櫛孔扇貝曝污于不同濃度（0.025μg/L、0.5μg/L、10μg/L）的B[α]P染毒10d，分別于染毒后0d、1d、3d、6d和10d取樣，通過檢測(cè)DNA堿解旋分析、脂質(zhì)LPO水平和蛋白質(zhì)羰基含研究了B[α]P對(duì)櫛孔扇貝性腺造成的DNA損傷和過氧化損傷。結(jié)果表明0.5μg/L和10

10、μg/L B[α]P可對(duì)性成熟期的櫛孔扇貝卵巢造成顯著的DNA斷裂損傷，濃度越高，損傷越嚴(yán)重，并隨染毒時(shí)間增加卵巢的DNA斷裂不能得到修復(fù)。不同濃度的B[α]P對(duì)櫛孔扇貝性腺均造成了脂質(zhì)LPO與蛋白質(zhì)羰基化程度的升高，并且MDA、蛋白羰基含量與B[α]P之間存在顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系，但是隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)均會(huì)不同程度的降低。0.025和0.5μg/L B[α]P處理組的脂質(zhì) LPO和蛋白羰基含量在實(shí)驗(yàn)取樣終點(diǎn)時(shí)一般能夠降至至對(duì)照組水平，但

11、是10μg/L B[α]P不能恢復(fù)至對(duì)照組水平。雄性櫛孔扇貝的精巢組織要比雌性櫛孔扇貝的卵巢組織更敏感，表現(xiàn)在同濃度的B[α]P暴露在精巢中引起的過氧化損傷均比在卵巢中更顯著和/或者更難以得到修復(fù)。
　　4、B[α]P對(duì)櫛孔扇貝性腺顯微結(jié)構(gòu)的影響
　　本實(shí)驗(yàn)將櫛孔扇貝曝污于不同濃度（0.025μg/L、0.5μg/L、10μg/L）的B[α]P染毒10d，通過櫛孔扇貝的卵巢和精巢的顯微結(jié)構(gòu)觀察可知，相對(duì)于對(duì)照組，0.5μg/