短小芽孢桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)化研究.pdf

1、綠色熒光蛋白(GFP)基因作為標記基因,被廣泛應用于環(huán)境微生物學方面,由于其表達穩(wěn)定,容易觀測,因此,也可以作為啟動子活性的報告基因.為了進一步優(yōu)化短小芽孢桿菌表達系統(tǒng),以GFP作為報告基因,對克隆自DX01菌株的啟動子進行了一系列的研究.采用PCR技術,亞克隆來自短小芽孢桿菌(Bacillus brevis)DX01菌株總基因組中的啟動子活性片段F1,分別構建了大腸桿菌組成型表達載體pUC118-F1gfp和一個大腸桿菌-短小芽孢桿菌

2、穿梭表達載體pHY300-F1gfp,以缺失啟動子的綠色熒光蛋白(GFP)基因為報告基因,檢測了該片段在大腸桿菌DH5α和短小芽孢桿菌DX01菌株中的啟動活性,在熒光顯微鏡下,均觀察到了明亮的綠色熒光,證實活性片段F1具有組成型啟動子的功能,gfp基因對2種宿主細胞中實現(xiàn)了組成型表達.該表達結果為Western印跡所證實.對2種宿主表達細胞中GFP蛋白的表達量作了FACS分析,結果表明gfp基因在DX01細胞中的表達強度約為DH5α中的

3、2倍.運用來自噬菌體Mu的轉座酶MuA,對啟動子F1進行了隨機插入突變,從中篩選出13個F1的突變體.對突變體的氯霉素抗性檢測表明,與F1對照相比,7個含相應突變體的菌株其氯霉素抗性水平有顯著提高,其中突變體Fm3和Fm10抗性提高了3.6倍,可抗高達900μg/mL氯霉素,揭示這些啟動子突變體有著更高的啟動活性;4個突變體氯霉素抗性水平下降;2個突變體抗性水平基本不變.CAT-ELISA檢測的結果,也進一步證實了氯霉素抗性水平的變化與

4、CAT酶活力的變化有著密切的關系.在啟動子F1的DNA序列上,存在著不同插入效應敏感位點,在這些位點附近的插入突變,可使啟動活性急劇變化,并且相鄰的插入位點,其突變效應可能完全不同.FACS分析表明,在大腸桿菌中表現(xiàn)為啟動活性增強的F1突變體,轉入短小芽孢桿菌DX01后其活性仍表現(xiàn)為增強.采用RT-PCR方法,克隆了蘿卜抗真菌蛋白1(Rs-AFP1)的cDNA全長,在該基因的上游連上了一個短小芽孢桿菌47株的中壁蛋白(MWP)信號肽,將