結(jié)核桿菌感染致腎損傷與IgA腎病發(fā)病相關(guān)性研究.pdf

1、目的: IgA腎病(IgAN)為一免疫病理學(xué)診斷名稱，腎活檢免疫病理結(jié)果為腎小球系膜區(qū)以IgA顆粒樣沉積為主，臨床上以血尿、蛋白尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)的腎小球腎炎。某些系統(tǒng)性疾病，如過敏性紫癜、肝硬化等也可導(dǎo)致腎小球系膜區(qū)IgA為主的免疫球蛋白沉積，但還沒有系統(tǒng)研究可以證實(shí)結(jié)核桿菌感染是否能夠?qū)е履I小球系膜區(qū)有IgA為主的免疫球蛋白沉積。結(jié)核分枝桿菌(MTB)對(duì)腎臟的損傷分為臨床腎結(jié)核、病理腎結(jié)核、結(jié)核性變態(tài)反應(yīng)綜合征和/或結(jié)核性自身免疫

2、性疾病腎損傷。但由于尿培養(yǎng)MTB需要4周，結(jié)核菌向尿中排放成間歇性，菌陰結(jié)核占結(jié)核總數(shù)的70％，所以MTB相關(guān)腎臟損傷早期診斷與防治均尚十分薄弱。 本試驗(yàn)?zāi)康氖沁M(jìn)一步明確腎組織上表達(dá)結(jié)核分枝桿菌Ag85(MTB-Ag85)在結(jié)核桿菌感染致早期腎損傷診斷中的意義，并在已證實(shí)有結(jié)核桿菌感染患者腎活檢組織中，檢測(cè)MTB-Ag85和IgA1，探討二者表達(dá)的相關(guān)性。 材料和方法: 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本及分組

3、 本研究所選各組病例均來自2005年至2007年在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院患者，平均年齡為42.5±19.5歲。 (1)陽性對(duì)照組：泌尿外科住院的臨床腎結(jié)核患者外科手術(shù)切除腎組織石蠟切片，及其術(shù)前24小時(shí)尿沉渣，其中6名男患、4名女患，共10例。 (2)陰性對(duì)照組：腎內(nèi)科住院的無結(jié)核病史及活動(dòng)結(jié)核灶、PPD或血結(jié)核抗體檢驗(yàn)均為陰性，臨床確診為非IgAN的原發(fā)性腎小球腎炎患者腎組織石蠟切片，及其24小時(shí)尿沉渣，其

4、中6名男患、6名女患，共12例。 (3)實(shí)驗(yàn)組：腎內(nèi)科住院的具有結(jié)核病史或活動(dòng)結(jié)核灶、PPD2+或血結(jié)核抗體兩次陽性、尿培養(yǎng)或尿沉渣查抗酸桿菌陽性腎病患者的腎活檢組織石蠟切片，及其24小時(shí)尿沉渣，其中20名男患、22名女患，共42例。 2、主要試劑和藥品 抗結(jié)核分枝桿菌抗原85(MTB-Ag85)、熒光黃標(biāo)記抗人免疫球蛋白A1(Anti-Human IgA1-FITC)、免疫組化SABC即用試劑盒、DAB顯色試劑

5、盒、生物素化羊抗小鼠IgG1。 3、主要儀器 37℃孵育箱、微波爐、烤片機(jī)、光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、顯微照相儀、顯微圖像分析儀、分光光度計(jì)。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、尿培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌收集 各組患者24小時(shí)尿液，去上清，留20ml沉渣，離心沉淀后，將沉渣加入4％氫氧化鈉溶液消化，無菌操作取上清液，離心后取管底沉渣，加入6％硫酸混勻，將此標(biāo)本全部接種與固體羅氏培養(yǎng)基斜面，置37℃溫箱培養(yǎng)，每周定時(shí)觀察生長

6、情況，如經(jīng)過2個(gè)月培養(yǎng)后仍無細(xì)菌生長為陰性結(jié)果。若有細(xì)菌生長，如生長慢，培養(yǎng)基呈干燥、顆粒狀乳酪色菌落，涂片染色抗酸性強(qiáng)，呈單個(gè)散在或索狀排列或成簇成團(tuán)的桿菌，則為有結(jié)核桿菌生長。 2、腎組織形態(tài)學(xué)檢查 腎組織標(biāo)本用4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE常規(guī)染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察。 3、免疫組織化學(xué)結(jié)果分析 SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色。顯微照相儀照相，顯微圖像分析儀對(duì)圖像定量分析。每張切片隨機(jī)

7、選取5個(gè)高倍視野(400倍)，測(cè)定其陽性染色物質(zhì)分光密度(Intergrate optical densty,IOD)值。 4、免疫熒光結(jié)果分析 直接熒光免疫法檢測(cè)各組標(biāo)本中的IgA1。熒光顯微照相儀照相，顯微圖像分析儀對(duì)圖像定量分析。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400倍)，測(cè)定其陽性染色物質(zhì)平均灰度值。 5、臨床資料分析PPD、與血結(jié)核抗體檢測(cè)。 6、統(tǒng)計(jì)分析方法 計(jì)量資料x2檢驗(yàn)分析各組相關(guān)

8、性，SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析處理數(shù)據(jù)，P≤0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1、尿培養(yǎng)查結(jié)核分枝桿菌陽性對(duì)照組10例患者尿中3例結(jié)核分枝桿菌陽性。陰性對(duì)照組患者尿中結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)均陰性。實(shí)驗(yàn)組42例患者尿中7例結(jié)核分枝桿菌陽性。 2、腎組織病理檢測(cè) (1)實(shí)驗(yàn)組腎活檢病理診斷結(jié)果實(shí)驗(yàn)組42例，經(jīng)該院中心實(shí)驗(yàn)室會(huì)診診斷其中有26例為IgAN，8例為非IgA輕中度系膜增生性腎小球腎炎，4例為硬化性腎小

9、球腎炎，2例為輕微病變型腎小球腎炎，2例為膜性腎病。 (2)免疫組織化學(xué)檢測(cè)MTB-Ag85結(jié)果陽性對(duì)照組腎組織中MTB-Ag85均為陽性，可見褐色顆粒狀陽性物質(zhì)沉積在腎間質(zhì)、腎小管細(xì)胞的胞漿及腎小球系膜區(qū)、毛細(xì)血管基底膜。 陰性對(duì)照組腎組織中1例可見淺褐色物質(zhì)片狀分布于組織邊緣部分腎間質(zhì)。 實(shí)驗(yàn)組腎組織中27例可見褐色顆粒狀陽性物質(zhì)沉積在腎間質(zhì)、腎小管細(xì)胞的胞漿及部分腎小球系膜區(qū)、毛細(xì)血管基底膜。腎臟病理損傷嚴(yán)

10、重部位陽性物質(zhì)沉積亦較多。 陽性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組IOD值分別為(36.54±10.06)×103和(33.69±11.82)×103，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (3)免疫熒光檢測(cè)IgAl結(jié)果陽性對(duì)照組均見腎小球系膜區(qū)、毛細(xì)血管袢及部分腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)可見黃綠色陽性物質(zhì)顆粒樣沉積。 陰性對(duì)照組腎組織中IgAl表達(dá)均陰性。 實(shí)驗(yàn)組腎組織切片中，35例腎組織上檢測(cè)到IgAl，其中免疫熒光診為IgAN的26例、非

11、IgA系膜增生腎小球腎炎8例、硬化性腎小球腎炎1例，黃綠色陽性物質(zhì)顆粒樣物質(zhì)主要沉積于腎小球系膜區(qū)、毛細(xì)血管袢及部分腎小管細(xì)胞胞漿內(nèi)；7例腎組織上未檢測(cè)到IgAl，其中病理類型為硬化性腎小球腎炎3例、輕微病變型腎小球腎炎2例和膜性腎病2例。 陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的灰度測(cè)定分別為(59.83±4.16)、(10.02±1.38)和(57.94±4.08)，陽性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的平均灰度值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；陰性對(duì)照組與陽性對(duì)

12、照組或?qū)嶒?yàn)組的平均灰度值比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3、實(shí)驗(yàn)組尿培養(yǎng)MTB、PPD檢測(cè)、血結(jié)核抗體檢測(cè)三種常用結(jié)核診斷方法與MTB-Ag85檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析 實(shí)驗(yàn)組MTB-Ag85的陽性表達(dá)與尿培養(yǎng)結(jié)果之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有關(guān)聯(lián)性，其關(guān)聯(lián)系數(shù)C值為0.548；與PPD檢測(cè)結(jié)果之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有關(guān)聯(lián)性，其關(guān)聯(lián)系數(shù)C值為0.323；與血結(jié)核抗體檢測(cè)結(jié)果之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有關(guān)聯(lián)性，其關(guān)聯(lián)系數(shù)C值為0.298。 結(jié)論： 1、腎