紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中褐化機(jī)理及其控制.pdf

1、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)珍貴次級(jí)代謝產(chǎn)物是目前最具應(yīng)用前景的植物資源替代技術(shù)之一，并且該技術(shù)仍在不斷擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域，例如生產(chǎn)異源動(dòng)物蛋白等。但是植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還有很多關(guān)鍵問(wèn)題亟待解決，其中，褐化現(xiàn)象幾乎存在于所有植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用和研究中，以及植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的放大過(guò)程中，是嚴(yán)重妨礙植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題之一。然而，由于植物細(xì)胞本身的特點(diǎn)及其培養(yǎng)環(huán)境的復(fù)雜性，目前，人們對(duì)其褐化機(jī)理仍然沒(méi)有清楚地認(rèn)識(shí)，褐化問(wèn)題仍無(wú)

2、有效的控制方法。因此，本論文以極易發(fā)生褐化、且具有應(yīng)用前景的紅豆杉細(xì)胞為典型實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)系統(tǒng)研究揭示植物細(xì)胞培養(yǎng)的褐化機(jī)理，并在此基礎(chǔ)上建立針對(duì)、有效控制方法。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴系統(tǒng)研究了紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的褐化特征，并證明紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)褐化現(xiàn)象屬于生理的酶促褐化反應(yīng)。表現(xiàn)在：褐化現(xiàn)象發(fā)生于紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)的整個(gè)放大過(guò)程之中，并且該現(xiàn)象是在沒(méi)有加熱處理的常溫培養(yǎng)狀態(tài)下發(fā)生的；當(dāng)培養(yǎng)基中只含蔗糖成分，并且是通過(guò)過(guò)濾除菌方

3、式添加時(shí)，褐化現(xiàn)象仍然發(fā)生；硫代硫酸鈉可通過(guò)抑制多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性來(lái)控制褐化現(xiàn)象的發(fā)生；超生聲處理模擬機(jī)械損傷可誘導(dǎo)提高紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)褐化程度。⑵證明可代謝碳源調(diào)控的酚類(lèi)物質(zhì)合成是引起紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)酶促褐化的決定性因素。系統(tǒng)研究了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的環(huán)境因素（培養(yǎng)基成分、滲透壓、流體剪切、溶氧、蔗糖濃度、碳源）和酶促褐化之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)雖然上述因素均在一定程度上影響褐化程度，但是培養(yǎng)液中蔗糖成分影響

4、最大。當(dāng)培養(yǎng)液中無(wú)蔗糖存在時(shí)，無(wú)褐化現(xiàn)象發(fā)生；當(dāng)提高培養(yǎng)液中蔗糖濃度時(shí)，細(xì)胞總酚合成能力增強(qiáng)，導(dǎo)致褐化程度升高；并且在紅豆杉細(xì)胞中超表達(dá)蔗糖代謝關(guān)鍵酶中性/堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Neutral/alkaline invertase，NINV）基因同樣可通過(guò)促進(jìn)酚類(lèi)物質(zhì)合成提高褐化程度。此外，葡萄糖和果糖作為碳源同樣可通過(guò)促進(jìn)總酚合成導(dǎo)致褐化現(xiàn)象的發(fā)生，而非代謝糖如甘露醇和山梨醇作為碳源卻不能導(dǎo)致褐化現(xiàn)象的發(fā)生。在培養(yǎng)液中含有可代謝碳源的前提下

5、，滲透壓和流體剪切主要通過(guò)對(duì)細(xì)胞造成損傷，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)酚類(lèi)物質(zhì)和PPO釋放并相互接觸，從而誘發(fā)酶促褐化反應(yīng)的發(fā)生；提高培養(yǎng)液中溶氧水平，可通過(guò)促進(jìn)總酚合成導(dǎo)致褐化程度升高。⑶發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)物質(zhì)是引起紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)酶促褐化的主要酚類(lèi)物質(zhì)。主要證據(jù)為：通過(guò)對(duì)兩種細(xì)胞系（嚴(yán)重褐化細(xì)胞系和非褐化細(xì)胞系）的比較分析，并且提取培養(yǎng)液中的褐色物質(zhì)行紫外全波長(zhǎng)掃描以及HPLC-MS/MS檢測(cè)分析，證實(shí)黃酮類(lèi)物質(zhì)是引起酶促褐化反應(yīng)的主要酚類(lèi)物質(zhì)，并推測(cè)楊梅素和

6、槲皮素是參與該反應(yīng)的具體黃酮類(lèi)物質(zhì)。赤霉素作為抑制劑可通過(guò)抑制黃酮物質(zhì)的合成而阻止紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)酶促褐化的發(fā)生，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。通過(guò)研究赤霉素對(duì)紅豆杉細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和黃酮代謝產(chǎn)物的影響，揭示了赤霉素阻止紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)酶促褐化的機(jī)理。赤霉素處理雖然整體上提高了苯丙烷途徑和黃酮合成途徑的大部分基因的表達(dá)量，但是對(duì)苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶肉桂酸-4-CoA連接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）基因以及黃酮醇合成關(guān)鍵酶黃酮醇

7、合成酶（Flavonol synthase，F(xiàn)LS）基因表達(dá)起到明顯的抑制作用，最終抑制了總黃酮和黃酮醇物質(zhì)（楊梅素和槲皮素）的合成，從而阻止了酶促褐化的發(fā)生。⑷根據(jù)上述研究結(jié)果，概括、總結(jié)了紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)酶促褐化機(jī)理，并在此基礎(chǔ)上建立了3種可行有效的控制方法。蔗糖流加培養(yǎng)：通過(guò)降低細(xì)胞培養(yǎng)初期蔗糖濃度降低酚類(lèi)物質(zhì)的合成，從而降低的褐化程度。小細(xì)胞聚集體培養(yǎng)：小細(xì)胞聚集體可降低流體剪切對(duì)細(xì)胞的損傷而避免酶促褐化的發(fā)生，顯著促進(jìn)生物量的積