固有免疫識(shí)別受體RIG-IN端結(jié)構(gòu)域?qū)BV復(fù)制的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一種很小的包膜病毒,屬于DNA病毒科,HBV持續(xù)感染是導(dǎo)致慢性肝炎后肝硬化、肝細(xì)胞性肝癌等疾病的重要原因,嚴(yán)重威脅著人類健康,目前全世界約有3.5億慢性HBV感染者,約占全球人口的6％,我國(guó)作為乙肝的高發(fā)流行區(qū),占全球HBV表面抗原總攜帶率的近50％,且60％的人受過(guò)HBV的感染。
　　 固有免疫應(yīng)答是機(jī)體抗病毒感染免疫的第一道防線,這一過(guò)程的啟動(dòng)需要PRR(patte

2、rn recognition receptor,模式識(shí)別受體)識(shí)別病毒的某些成份,進(jìn)而活化下游的信號(hào)途徑。在PRR中除了我們所熟知的Toll受體家族,近年來(lái)一類Toll非依賴性PRR也成為固有免疫的研究熱點(diǎn),這其中RIG-I(retinoid induced gene-I,維甲酸誘導(dǎo)基因I)因其表達(dá)譜廣、識(shí)別病毒類型多而備受關(guān)注。研究證實(shí)RIG-I信號(hào)途徑在dsRNA(double stranded RNA,雙鏈RNA)病毒的固有免疫應(yīng)

3、答過(guò)程中發(fā)揮重要作用,其信號(hào)的傳導(dǎo)主要由RIG-I N端CARD結(jié)構(gòu)域(RIG-IN)介導(dǎo),RIG-IN被活化后,可通過(guò)蛋白-蛋白結(jié)合方式,激活下游接頭蛋白,進(jìn)而活化NF-kB和IRF(interferon regulatory factor,干擾素調(diào)節(jié)因子),最終引起干擾素和炎性因子的大量釋放,發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。
　　 固有免疫應(yīng)答在HBV的抗感染過(guò)程中有著很重要的地位,Chisari[10]等證實(shí)TLR及其配體在體內(nèi)可抑制HB

4、V的復(fù)制,且這些TLR配體主要通過(guò)誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生而抑制HBV DNA的合成。但目前并不清楚RIG-I信號(hào)途徑在HBV抗感染免疫中的角色。本研究中,我們利用HBV感染體內(nèi)外模型研究RIG-IN對(duì)HBV復(fù)制的影響,探討RIG-I信號(hào)途徑在HBV抗感染過(guò)程中的作用及其機(jī)制。
　　 第一部分:pcDNA-RIG-IN質(zhì)粒鑒定及HBV感染體內(nèi)外模型的建立
　　 RIG-I,又名Ddx58,是近年來(lái)比較熱門的Toll非依賴性模

5、式識(shí)別受體,定位在人染色體10q11-15,豬染色體的10q13。它有925個(gè)氨基酸,屬于DExD/H家族。RIG-I在N端包含一前一后兩個(gè)CARD(caspase recruitment domain,半胱天冬酶招募結(jié)構(gòu)域),這一結(jié)構(gòu)域也為其他的胞內(nèi)識(shí)別受體所具有,如NOD1、NOD2,C端有—RNA解旋酶(Helicase)結(jié)構(gòu)域,此外,在RIG-IC端有一抑制性結(jié)構(gòu)域,可負(fù)調(diào)控RIG-IN介導(dǎo)的信號(hào)途徑,研究表明RNA病毒一般為R

6、IG-I Helicase結(jié)構(gòu)域識(shí)別,其信號(hào)由RIG-I N端結(jié)構(gòu)域傳導(dǎo)。
　　 課題的第一部分是鑒定pcDNA-RIG-IN質(zhì)粒并建立HBV感染的體內(nèi)外模型。pcDNA-RIG-IN質(zhì)粒經(jīng)Nhel和BamHI酶切后顯示有一約790bp大小的插入片段,測(cè)序結(jié)果顯示在pcDNA載體中已克隆進(jìn)RIG-I N端2-229位氨基酸,序列正確且在前面帶有myc標(biāo)簽蛋白;為在體外檢測(cè)RIG-IN對(duì)HBV復(fù)制的影響,我們首先建立HBV感染的細(xì)

7、胞模型,因嗜肝DNA病毒具有組織特異性,因此我們選取了分化成熟的肝癌細(xì)胞系HepG2來(lái)建模,使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染將HBV質(zhì)粒pTHBV導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),通過(guò)檢測(cè)上清中HBV s抗原(HBsAg)和HBV e抗原(HBeAg)的表達(dá)量,證實(shí)HBV在這兩株細(xì)胞系中均可有效復(fù)制,從而建立HBV感染細(xì)胞模型。
　　 體內(nèi)我們通過(guò)高壓注射法建立HBV感染小鼠模型,將pTHBV從尾靜脈快速注入正常BALB/c小鼠體內(nèi),在注射后1、2、4、7、10天收集

8、小鼠血清,用ELISA法檢測(cè)HBsAg和HBeAg的表達(dá)量;結(jié)果顯示在注射后24小時(shí)以內(nèi),即產(chǎn)生高水平的HBsAg及naeAg;從第2天開(kāi)始,血清中HasAg及HReAg的水平下降,至第10天抗原水平已很難測(cè)到;以上數(shù)據(jù)證實(shí)高壓注射法可建立HBV感染的體內(nèi)模型。
　　 第二部分RIG-I N端結(jié)構(gòu)域?qū)BV復(fù)制的影響
　　 在質(zhì)粒鑒定正確且HBV感染模型成功建立的基礎(chǔ)上,課題的第二部分是關(guān)注RIG-IN對(duì)HBV復(fù)制的影響

9、,分為體內(nèi)和體外兩方面的研究。體外我們通過(guò)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)的方法,將RIG-IN和pTHBV共轉(zhuǎn)進(jìn)HepG2細(xì)胞中,同時(shí)設(shè)立pcDNA和pTHBV共轉(zhuǎn)染組為對(duì)照組,在轉(zhuǎn)染1、2、3天后收集上清用ELISA法檢測(cè)HBsAg和HBeAg的表達(dá)量;用Northern blot法檢測(cè)HBV轉(zhuǎn)錄本水平;用real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HBV復(fù)制中間體DNA的水平。結(jié)果顯示RIG-IN和pTHBV轉(zhuǎn)染組,相比空質(zhì)粒對(duì)照組,上清中抗原表達(dá)量明顯降低,通

10、過(guò)共轉(zhuǎn)GFP,我們未發(fā)現(xiàn)空質(zhì)粒對(duì)照組和RIG-IN組在轉(zhuǎn)染效率上有顯著區(qū)別;而且Northern blot結(jié)果顯示RIG-IN組的3.5kb及2.4/2.1kb轉(zhuǎn)錄本水平均明顯降低;進(jìn)一步為明確RIG-IN對(duì)HBV復(fù)制的影響,我們從轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞內(nèi)提取病毒顆粒,用熒光定量PCR檢測(cè)cccDNA拷貝數(shù)(covalently dosed circular DNA copies),結(jié)果顯示pcDNA轉(zhuǎn)染組HBV-DNA拷貝數(shù)為6.1×105,相

11、比之下RIG-IN轉(zhuǎn)染組HBV-DNA拷貝數(shù)為3.2×105,即.RIG-IN可下調(diào)HBV-DNA拷貝數(shù)50％。
　　 在體外證實(shí)RIG-IN對(duì)HBV復(fù)制的抑制作用后,那么在體內(nèi)RIG-IN是否有類似的抑制效應(yīng),將正常BALB/c小鼠分為空質(zhì)粒對(duì)照組和RIG-IN質(zhì)粒組,通過(guò)尾靜脈快速注ApTHBV和pcDNA或RIG-IN,在注入質(zhì)粒1、4、7天后比較兩組HBV血清學(xué)指標(biāo),結(jié)果顯示RIG-IN組HBsAg只有空質(zhì)粒對(duì)照組的41

12、％,HBeAg為空質(zhì)粒對(duì)照組的50％;為進(jìn)一步證實(shí)RIGI-N在體內(nèi)對(duì)HBV的抑制作用,我們用免疫組化的方法檢測(cè)小鼠肝組織中HBcAg的表達(dá),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后1、4、7天,RIG-IN轉(zhuǎn)染組HBcAg陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目相對(duì)于pcDNA轉(zhuǎn)染組明顯減少,而且在胞漿和胞核內(nèi)都觀察到HBcAg的存在。
　　 這部分結(jié)果顯示RIG-IN可抑制HBV復(fù)制中間體DNA的合成,降低HBV轉(zhuǎn)錄本水平及病毒蛋白的表達(dá)。
　　 第三部分RIG-I

13、N端結(jié)構(gòu)域在影響HBV復(fù)制中的作用機(jī)制
　　 已有大量研究表明NF-κB和I型干擾素信號(hào)通路的激活可明顯抑制HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,為進(jìn)一步了解RIG-IN抑制HBV的作用機(jī)制,我們以核因子kappa B以及I型干擾素的熒光報(bào)告質(zhì)粒,檢測(cè)RIG-IN對(duì)它們的作用,結(jié)果顯示相比空質(zhì)粒對(duì)照組,RIG-IN轉(zhuǎn)染組可明顯上調(diào)NF-κB至2.4倍;IFN-α至2倍;IFN-β至10倍,提示RIG-IN可能是通過(guò)活化NF-κB和I型干擾素信號(hào)途

14、徑而發(fā)揮對(duì)HBV的抑制效應(yīng)。為明確RIG-IN對(duì)HBV轉(zhuǎn)錄抑制的分子機(jī)制,我們用熒光報(bào)告質(zhì)粒的方法檢測(cè)RIG-IN對(duì)Sp Ⅰ、SpⅡ、Core、Ⅹ四種HBV啟動(dòng)子的影響,有趣的是,我們的結(jié)果顯示RIG-IN可明顯下調(diào)這四個(gè)HBV啟動(dòng)子活性。
　　 以上研究結(jié)果表明,這部分結(jié)果顯示RIG-INZ可抑制HBV復(fù)制中間體DNA的合成,降低HBV轉(zhuǎn)錄本水平及病毒蛋白的表達(dá);進(jìn)一步在體內(nèi)我們也觀察到RIG-IN不僅下調(diào)HBV病毒蛋白水平,

15、也可降低HBcAg陽(yáng)性的肝細(xì)胞數(shù),提示RIG-IN在體內(nèi)也有類似的抑制效應(yīng);在這些現(xiàn)象的基礎(chǔ)上,我們以NF-κB和I型干擾素的熒光報(bào)告質(zhì)粒,觀察RIG-IN對(duì)這兩種啟動(dòng)子活性的影響,結(jié)果顯示RIG-IN在所研究的HepG2細(xì)胞中可明顯上調(diào)NF-κB至2。4倍;IFN-α至2倍;IFN-β至10倍,提示RIG-IN對(duì)HBV的抑制作用可能與NF-κB和I型干擾素信號(hào)途徑的活化有關(guān),通過(guò)檢測(cè)HBV四個(gè)啟動(dòng)子的熒光素酶活性,發(fā)現(xiàn)RIG-IN可抑

16、制HBV啟動(dòng)子活性,提示RIG-IN對(duì)HBV轉(zhuǎn)錄水平的抑制可能是通過(guò)下調(diào)HBV啟動(dòng)子活性而實(shí)現(xiàn)。
　　 綜合以上研究,我們的結(jié)果顯示RIG-IN可抑制HBV復(fù)制及轉(zhuǎn)錄并下調(diào)HBV蛋白表達(dá)水平,其機(jī)制可能在于RIG-IN活化了NF-κB和I型干擾素信號(hào)途徑,我們還觀察到RIG-IN明顯下調(diào)HBV四種啟動(dòng)子的活性,這可能與RIG-IN對(duì)HBV的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān),但因?yàn)镽IG-I在胞漿內(nèi)可與其他蛋白結(jié)合,目前還不清楚RIG-IN的這種抑制