密骨方對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是目前世界人口老齡化重點(diǎn)防治的病癥。骨質(zhì)疏松癥的嚴(yán)重后果是骨折，骨質(zhì)疏松性骨折(Osteoporotic fracture，OPF)存在不愈合或延遲愈合的危險(xiǎn)，嚴(yán)重影響患者身體健康與生活質(zhì)量，甚至?xí)職?、致死。OPF以粉碎性骨折居多，骨折部位骨的質(zhì)量降低，強(qiáng)度變?nèi)酰委熓掷щy，醫(yī)療費(fèi)用非常驚人。盡管近年來在防治OP方面已取得了很大的成就，但至今仍未找到令人滿意的防治OPF方法

2、。因此，防治OPF是當(dāng)今研究的熱門課題。 關(guān)于促進(jìn)OPF愈合的藥物，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要應(yīng)用雌激素替代療法、氟化物、雙膦酸鹽、降鈣素和鈣制劑等，雖有一定療效，但有相當(dāng)大的副作用，能否長期服用一直存在爭議。中醫(yī)中藥在促進(jìn)OPF愈合方面的進(jìn)展逐漸為醫(yī)藥學(xué)者所重視。從臨床癥狀上看OPF可歸屬為中醫(yī)學(xué)中“骨痿，骨?！狈懂?，根據(jù)“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨”，認(rèn)為OPF與中醫(yī)的“腎”有非常密切的關(guān)系。 本研究是在建立去卵巢Wistar大鼠骨質(zhì)

3、疏松骨折模型的基礎(chǔ)上，用中藥密骨方(Migufang，MGF)進(jìn)行干預(yù)，通過免疫組化、分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法，探討雌激素缺乏時(shí)產(chǎn)生OPF在骨折愈合過程中的相關(guān)因子在不同時(shí)期生物學(xué)特征，以闡明MGF在去卵巢OPF骨折愈合過程中的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥在防治OPF的應(yīng)用開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.骨質(zhì)疏松骨折動(dòng)物模型的建立6月齡成年雌性wistar大鼠90只，260-300克，隨機(jī)分為3組，假去卵巢對(duì)照組(Sham)30只，模

4、型組(OVX)30只，密骨方治療組(MGF)30只。 MGF組與OVX組完整摘除雙側(cè)卵巢，sham組只切除同量的脂肪。飼養(yǎng)3個(gè)月后全部在右后側(cè)股骨中上1/3段建立閉合性骨折模型。 2.給藥方法：骨折固定術(shù)后，MGF組按10 mg、(kg.d)密骨方湯劑(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院老年醫(yī)藥學(xué)研究所提供)灌胃，OVX組與Sham組給予同量的生理鹽水，療程為2周、4周、6周。 3.觀察指標(biāo)及測(cè)定方法3.1血液生化的變化：術(shù)

5、后2周、4周及6周在每組隨機(jī)選取5只大鼠摘眼球取血，離心5min取血清，用放射免疫法檢測(cè)血清E2、血清BGP，用生化分析儀檢測(cè)血清ALP。 3.2骨折愈合過程骨折端IL-6、TGF-β1的動(dòng)態(tài)變化：采用SABC染色法，并用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)作圖像分析。檢測(cè)術(shù)后2周、4周及6周骨折端IL-6、TGF-β1的表達(dá)。 3.3骨折愈合過程骨折端BMP-3、OPG的動(dòng)態(tài)變化：采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈

6、反應(yīng)(RT-PCR)法，檢測(cè)術(shù)后2周、4周及6周骨折端BMP-3mRNA、OPGmRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1.血液生化的變化： 1.1 MGF對(duì)去卵巢大鼠血清E2的影響((-X)±s)OVX組在各時(shí)間段均顯著低于Sham組與MGF組(P<0.05)；MGF組在第2周和第4周的血清E2均顯著低于Sham組(P<0.05)；MGF組在第6周的血清E2均顯著高于Sham組(P<0.05)； OVX組與MGF組血清E2在

7、時(shí)間上有顯著升高均勢(shì)(P<0.05)。Sham組在時(shí)間上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 1.2 MGF對(duì)去卵巢大鼠血清BGP的影響((-X)±s)Sham組在三個(gè)時(shí)間段內(nèi)無顯著性差異(P>O．05)。MFG組在三個(gè)時(shí)間段有降低趨勢(shì)且有顯著性差異(P<0.05)。MFG組血清BGP值在第6周顯著低于Sham組(P<0.05)。OVX組血清BGP值在三個(gè)時(shí)間段內(nèi)有升高趨勢(shì)，且各組間有顯著性差異(P<0.05)。 1.3 MG

8、F對(duì)去卵巢大鼠血清ALP的影響((-X)±s)Sham組在三個(gè)時(shí)間段內(nèi)無顯著性差異(P>0.05)。OVX組在第2周顯著高于Sham組(P<0.05)。MFG組血清ALP值總體比較有顯著降低趨勢(shì)(P<0.05)。OVX組血清ALP值總體比較有顯著升高的趨勢(shì)(P<0.05)。各組在第4周時(shí)血清ALP值最低(P<0.05)。 2.組織學(xué)觀察： 2.1 Sham組與OVX組的比較： 2.1.1骨折后2周，OVX組軟骨性

9、骨痂形成以取代纖維骨痂，早期纖維骨痂內(nèi)軟骨島出現(xiàn)，不斷擴(kuò)展，血管周圍軟骨細(xì)胞多體積較小的圓形幼稚軟骨細(xì)胞，隨著時(shí)間的推移，軟骨痂周邊部軟骨細(xì)胞大部分變性壞死，并出現(xiàn)少量原始(幼稚)小梁狀骨，原始小梁狀骨邊成骨細(xì)胞數(shù)較少，原始骨小梁間為結(jié)締組織(包括血細(xì)胞)。Sham組原始小梁狀骨表面可見大量排列整齊的成骨細(xì)胞。 2.1.2骨折后4周，OVX組骨痂量少，纖維結(jié)締組織逐漸減少，軟骨性骨痂逐漸增多。Sham組骨折端出現(xiàn)大部分骨性愈合，

10、且有連續(xù)性骨痂包繞。 2.1.3骨折后6周，OVX組軟骨痂周邊部繼續(xù)不斷為原始小梁狀骨(編織骨)替代，但軟骨性骨痂仍未吸收融合，仍有軟骨島出現(xiàn)；早期形成的原始小梁狀骨內(nèi)軟骨細(xì)胞或變性壞死或分化、轉(zhuǎn)化為骨細(xì)胞；同時(shí)，表面破骨細(xì)胞出現(xiàn)，并與成骨細(xì)胞相偶聯(lián)，使原始骨小梁不改建成為成熟骨小梁。OVX組與Sham組相比，小梁狀骨吸收快且被吸收數(shù)多，小梁間距增寬，其間充滿大量脂肪細(xì)胞。Sham組此時(shí)骨折端已大部分形成骨性骨痂。 2.

11、2 MGF組與OVX組的比較： 2.2.1骨折后2周，MGF組膜內(nèi)成骨與OVX組基本相似，在纖維性骨痂中出現(xiàn)軟骨島，并逐漸擴(kuò)大，并在軟骨痂周邊出現(xiàn)新生骨小梁。OVX組大量纖維組織及少數(shù)纖維性骨痂形成。OVX組的軟骨骨痂多于MGF組。MGF組纖維性骨痂較OVX組多見。 2.2.2骨折后4周，MGF組骨痂中骨性骨痂較多，軟骨細(xì)胞較少，未見到軟骨島存在，骨小梁粗細(xì)均勻一致，間距無明顯增寬，板層骨形成，周圍結(jié)締組織和骨髓腔可見較

12、多毛細(xì)血管植入。OVX組四周纖維結(jié)締組織逐漸減少，軟骨性骨痂逐漸增多。MGF已有少量成熟的骨性骨痂出現(xiàn)。 2.2.3骨折后6周，MGF組軟骨骨痂周邊部新生小梁狀骨不斷增加，在中早期形成的原始小梁狀骨內(nèi)軟骨細(xì)胞此時(shí)逐漸轉(zhuǎn)化為骨細(xì)胞，原始骨小梁不斷改建成為成熟骨小梁，骨小梁融合、粗大，軟骨成分減少，軟骨性骨痂已逐漸轉(zhuǎn)化為成熟的骨性骨痂。OVX組軟骨骨痂向骨性骨痂轉(zhuǎn)化緩慢，軟骨性骨痂仍未吸收融合，仍有軟骨島出現(xiàn)，透明樣軟骨仍然存在，軟

13、骨痂仍然較多。 3.免疫組化結(jié)果： 3.1 SABC染色組織學(xué)觀察：MGF組和OVX組在骨折愈合過程中TGF-β1、IL-6細(xì)胞因子的細(xì)胞定位無差別。TGF-β1主要定位于間充質(zhì)細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。IL-6主要定位于成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。 3.2 TGF-β1在骨折端的表達(dá)圖像分析結(jié)果：Sham組TGF-β1在骨折端的表達(dá)在時(shí)間的變化上無顯著性差異(P>0.05)；OVX組TGFβ1在骨折端的表

14、達(dá)在時(shí)間的變化上呈顯著減弱趨勢(shì)(P<0.05)；MGF組TGF-β1在骨折端的表達(dá)在時(shí)間的變化上呈顯著升高趨勢(shì)(P<0.05)；MGF組在4周與6周的TGF-β1在骨折端的表達(dá)結(jié)果顯著高于OVX組和Sham組。 3.3 IL-6在骨折端的表達(dá)圖像分析結(jié)果：Sham組IL-6在骨折端的表達(dá)在時(shí)間的變化上有顯著性減弱趨勢(shì)(P>0.05)；OVX組IL-6在骨折端的表達(dá)在時(shí)間的變化上呈顯著升高趨勢(shì)(P<0.05)；MGF組IL-6在骨

15、折端的表達(dá)在時(shí)間的變化上呈顯著減弱趨勢(shì)(P<0.05)；MGF組在4周與6周的IL-6在骨折端的表達(dá)結(jié)果顯著低于OVX組和Sham組。 4.熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法的檢測(cè)結(jié)果： 4.1 BMP-3 mRNA在骨折端的表達(dá)大鼠骨折端OPG mRNA表達(dá)的循環(huán)數(shù)值：在時(shí)間上的總體比較呈遞減的趨勢(shì)并有顯著性差異(F=153.19、P<0.05)；在組別的總體比較是OVX組

16、(F=262.23、P<0.05)；在時(shí)間與組別的交互比較也存在顯著性差異(F=81.50、P<0.05)；任兩組間都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)． 4.2 OPG mRNA在骨折端的表達(dá)大鼠骨折端OPG mRNA表達(dá)的循環(huán)數(shù)值：在時(shí)間上的總體比較呈遞減的趨勢(shì)并有顯著性差異(F=124.51、P<0.05)；在組別的總體比較是OVX組

17、存在顯著性差異(F=16.23、P<0.05)；任兩組間都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 結(jié)論： MGF對(duì)去卵巢大鼠OPF有促進(jìn)骨折愈合的作用。其作用機(jī)制是：有可能提高E水平促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收來調(diào)節(jié)骨代謝平衡；降低骨折斷端BMP-3的基因表達(dá)及提高TGF-β1的合成分泌，刺激成骨細(xì)胞生成和分化，從而促進(jìn)骨形成；降低骨折斷端OPG的基因表達(dá)及降低IL-6的合成分泌，降低破骨細(xì)胞的活性，從而抑制骨吸收?？傊?，MGF是從促