脂肪干細(xì)胞對周圍神經(jīng)再生作用潛能的研究.pdf

1、目的:臨床上周圍神經(jīng)損傷的患病率較高，并可由多種病因?qū)е?，為有效地恢?fù)神經(jīng)的連續(xù)性及其功能，臨床醫(yī)生及研究人員做了大量的研究工作。修復(fù)短距離的神經(jīng)損傷較為容易，可直接拉攏兩側(cè)神經(jīng)的殘端進(jìn)行縫合，恢復(fù)其神經(jīng)連續(xù)性。但是，長距離的神經(jīng)缺損由于神經(jīng)斷端張力的問題無法采用直接縫合的方法，進(jìn)行神經(jīng)或移植物移植就成為了唯一切實有效的辦法。自體神經(jīng)移植是臨床治療長距離周圍神經(jīng)缺損的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于供體資源有限、供區(qū)可能出現(xiàn)的感覺及功能減退、增加手術(shù)瘢痕

2、及創(chuàng)傷和受區(qū)神經(jīng)可能形成神經(jīng)瘤等缺點，局限了自體神經(jīng)移植的適應(yīng)癥。
　　近年來隨著再生醫(yī)學(xué)的興起，研究人員對于長距離周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)拓寬了思路，進(jìn)行了新的嘗試，旨在構(gòu)建再生的周圍神經(jīng)。同構(gòu)建其他再生組織一樣，有效地選擇、培養(yǎng)并移植種子細(xì)胞以及移植后細(xì)胞功能的有效發(fā)揮是再生周圍神經(jīng)成功修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。種子細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)再生的作用主要體現(xiàn)在其能夠分泌促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的生長因子及細(xì)胞外基質(zhì)，并通過其作用于再生的軸突。

3、　　脂肪干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，較易分離，在體外培養(yǎng)增殖較為迅速，且在一定條件下能夠誘導(dǎo)分化為類雪旺細(xì)胞，提示其可作為構(gòu)建再生周圍神經(jīng)的種子細(xì)胞。但脂肪干細(xì)胞植入宿主體內(nèi)后，其修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的機制尚不明確，向類雪旺細(xì)胞分化可能僅是其功能體現(xiàn)的一個方面。我們推測脂肪干細(xì)胞植入體內(nèi)后可能作為兩種狀態(tài)存在，未分化狀態(tài)和向類雪旺細(xì)胞分化狀態(tài)，類雪旺細(xì)胞分化可能是由于雪旺細(xì)胞釋放某些細(xì)胞因子促使脂肪干細(xì)胞向其分化，并可能發(fā)揮類

4、似雪旺細(xì)胞的功能，而未分化的脂肪干細(xì)胞則可能分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)雪旺細(xì)胞功能發(fā)揮促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的作用。
　　神經(jīng)支架必須滿足多種要求，包括構(gòu)建一個可滲透的，具備生物相容性的環(huán)境，從而允許細(xì)胞浸潤和恢復(fù)損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元連接。透明質(zhì)酸廣泛分布于動物體內(nèi)，是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，具有高度的親水性和粘彈性，很少與細(xì)胞粘連且可預(yù)防瘢痕的生成。在一系列包含細(xì)胞外纖維基質(zhì)的沉積及重塑的生物學(xué)進(jìn)程中，透明質(zhì)酸作為細(xì)胞-基質(zhì)相互作用在

5、細(xì)胞增殖及遷移過程中起到至關(guān)重要的作用。
　　本研究通過脂肪干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)，檢測其促進(jìn)神經(jīng)再生的分泌功能;通過體外間接共培養(yǎng)的方式，探討脂肪干細(xì)胞與雪旺細(xì)胞的相互作用關(guān)系及脂肪干細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)再生的相關(guān)機制;通過透明質(zhì)酸鈉水凝膠與脂肪干細(xì)胞體外相容性的研究，擬為周圍神經(jīng)再生尋找一種理想的支架材料。
　　研究方法:1、大鼠脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記
　　2、大鼠脂肪干細(xì)胞體外向脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞的分化誘

6、導(dǎo)
　　3、免疫熒光法及ELISA法檢測大鼠脂肪干細(xì)胞表達(dá)及分泌神經(jīng)生長因子(NGF)、膠源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、纖維粘連蛋白(Fibronectin)及層粘連蛋白(Laminin)的功能
　　4、大鼠雪旺細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及免疫熒光法鑒定S-100表達(dá)
　　5、大鼠脂肪干細(xì)胞體外向雪旺細(xì)胞的分化誘導(dǎo)
　　6、建立大鼠脂肪干細(xì)胞與雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)體系
　　分別取第三代大鼠脂肪干細(xì)胞與雪旺細(xì)胞通過Tra

7、nswell共培養(yǎng)皿（濾網(wǎng)孔隙直徑0.4μm）進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)。
　　7、免疫熒光及Western Blot法檢測誘導(dǎo)后和共培養(yǎng)后的脂肪干細(xì)胞S-100和GFAP的表達(dá)
　　8、RT-PCR檢測及共培養(yǎng)體系中雪旺細(xì)胞及對照組雪旺細(xì)胞NGF、GDNF、Fibronectin、Laminin的表達(dá)
　　9、ELISA檢測共培養(yǎng)體系中培養(yǎng)基上清液及脂肪干細(xì)胞和雪旺細(xì)胞對照組培養(yǎng)基上清液中NGF、GDNF、Fibronectin

8、、Laminin的含量
　　10、制備透明質(zhì)酸鈉水凝膠
　　11、CCK-8法檢測透明質(zhì)酸鈉水凝膠對脂肪干細(xì)胞的毒性作用及增殖作用
　　12、AnnexinⅤ-FITC和PI雙重染色檢測透明質(zhì)酸鈉水凝膠對脂肪干細(xì)胞的凋亡作用
　　13、與透明質(zhì)酸共培養(yǎng)的大鼠脂肪干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞的分化誘導(dǎo)
　　14、電鏡檢測透明質(zhì)酸鈉水凝膠表面及其內(nèi)部的細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)
　　15、免疫熒光檢測與透明質(zhì)酸鈉水凝膠共培養(yǎng)誘導(dǎo)

9、后的脂肪干細(xì)胞S-100和GFAP的表達(dá)
　　16、統(tǒng)計學(xué)處理
　　所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件分析，p＜0.05為差異有顯著性。
　　結(jié)果:1、體外提取大鼠脂肪干細(xì)胞并進(jìn)行傳代，第3代脂肪干細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)記結(jié)果顯示:CD29和CD44陽性，CD45和CD11陰性。脂肪干細(xì)胞生長曲線顯示細(xì)胞生長無明顯遲滯期，第6d達(dá)到生長峰值。
　　2、大鼠脂肪干細(xì)胞體外成脂誘導(dǎo)分化14d油紅染色脂滴處呈紅色，成骨

10、誘導(dǎo)分化21d茜素紅染色可見細(xì)胞形成典型的橘紅色鈣化結(jié)節(jié)。
　　3、免疫熒光及ELISA法檢測結(jié)果表明大鼠脂肪干細(xì)胞表達(dá)并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、GDNF及細(xì)胞外基質(zhì)Fibronectin、Laminin。
　　4、體外提取大鼠雪旺細(xì)胞并進(jìn)行傳代，第3代雪旺細(xì)胞免疫熒光染色可見S-100在細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)。雪旺細(xì)胞生長曲線顯示細(xì)胞在3d后開始快速增殖。
　　5、第三代脂肪干細(xì)胞分化培養(yǎng)基作用2w后，細(xì)胞由成纖維細(xì)胞樣或梭形

11、逐漸變?yōu)榧忓N形，且兩端可見較長的突起，形態(tài)類似雪旺細(xì)胞。
　　6、通過Transwell細(xì)胞共培養(yǎng)體系檢測到雪旺細(xì)胞培養(yǎng)48h后快速增殖，共培養(yǎng)體系中雪旺細(xì)胞增殖曲線與單純雪旺細(xì)胞對照組曲線類似，但總體的增殖速度卻要明顯高于對照組。
　　7、免疫熒光檢測結(jié)果顯示雪旺細(xì)胞、分化后的脂肪干細(xì)胞及共培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞S-100及GFAP呈陽性，而未分化的脂肪干細(xì)胞呈陰性。
　　8、Western Blot方法進(jìn)一步驗證雪旺細(xì)胞

12、、分化后的脂肪干細(xì)胞及共培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞顯示S-100及GFAP的免疫反應(yīng)條帶。但在未分化的脂肪干細(xì)胞未顯示。
　　9、RT-PCR檢測結(jié)果顯示共培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞較單純雪旺細(xì)胞對照組NGF、GDNF、Fibronectin及Laminin表達(dá)明顯增高。
　　10、ELISA檢測結(jié)果顯示共培養(yǎng)上清液中NGF、GDNF、Fibronectin及Laminin的含量較對照組明顯增高。
　　11、CCK-8進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測，共培

13、養(yǎng)3d后，第三代大鼠脂肪干細(xì)胞與透明質(zhì)酸鈉水凝膠共培養(yǎng)實驗組細(xì)胞活性明顯高于對照組。
　　12、細(xì)胞增殖檢測結(jié)果顯示，透明質(zhì)酸鈉水凝膠可以促進(jìn)未分化脂肪干細(xì)胞的增殖。
　　13、AnnexinⅤ-FITC和PI雙重染色結(jié)果顯示，隨著時間的增加，實驗組的細(xì)胞凋亡率較對照組的輕與透明質(zhì)酸鈉水凝膠共培養(yǎng)微升高。
　　14、與透明質(zhì)酸鈉水凝膠共培養(yǎng)第三代脂肪干細(xì)胞應(yīng)用分化培養(yǎng)基作用2w后，細(xì)胞由成纖維細(xì)胞樣或梭形逐漸變?yōu)榧忓N形

14、，且兩端可見較長的突起。免疫熒光檢測結(jié)果顯示分化后的脂肪干細(xì)胞S-100及GFAP呈陽性，而未分化的脂肪干細(xì)胞呈陰性。
　　15、掃描電鏡顯示未分化脂肪干細(xì)胞及分化的脂肪干細(xì)胞在透明質(zhì)酸鈉水凝膠表面均保持完整的細(xì)胞形態(tài)。
　　結(jié)論:1、自大鼠脂肪組織中能夠分離脂肪干細(xì)胞，并在體外穩(wěn)定傳代。大鼠脂肪干細(xì)胞可以表達(dá)并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子及細(xì)胞外基質(zhì)，為周圍神經(jīng)再生提供營養(yǎng)基礎(chǔ)及穩(wěn)定的微環(huán)境。2、大鼠脂肪干細(xì)胞可在體外向雪旺細(xì)胞分化，