兩種胰島β細(xì)胞PET顯像探針的制備與實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4的合成、標(biāo)記與質(zhì)控
　　目的：采用氟化鋁標(biāo)記法制備針對胰高血糖素肽-1受體（GLP-1R）的胰島β細(xì)胞顯像劑18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4，并進(jìn)行質(zhì)量控制分析。
　　方法：首先將Cys39-exendin-4與MAL-NOTA連接，制備成標(biāo)記前體NOTA-MAL-Cys39-exendin-4，并通過凍干工藝制作分裝。將已經(jīng)

2、制備好的 NOTA-MAL-Cys39-exendin-4通過Al18F一步法標(biāo)記法進(jìn)行合成反應(yīng)。通過高效液相色譜儀（HPLC）檢測與前體NOTA-MAL-Cys39-exendin-4紫外峰對照，并通過分析型HPLC方法測定放射化學(xué)純度，并測定其體外穩(wěn)定性。將18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4用PBS稀釋成1μCi/μl后加入0.5ml的正辛醇，離心、分層后用γ計(jì)數(shù)儀測放射性活度（CPM值），計(jì)算其油水分配

3、系數(shù)。經(jīng)ICR小鼠尾靜脈注射18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4注射液3.7×107Bq/0.2ml，觀察48h，后處死并解剖，觀察各器官受損情況。
　　結(jié)果：制備成功NOTA-MAL-Cys39-exendin-4，經(jīng)凍干工藝分裝于西林瓶中保存。其分子質(zhì)量經(jīng)LC-MS確定。Al18F一步法標(biāo)記NOTA-MAL-Cys39-exendin-4，全部過程可在30 min以內(nèi)完成，獲得產(chǎn)物18F-Al-NOT

4、A-MAL-Cys39-exendin-4。經(jīng)分析型HPLC檢測，放射性峰保留時間與前體NOTA-MAL-Cys39-exendin-4紫外峰保留時間一致。經(jīng)分析型HPLC檢測18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4，體外5.5h穩(wěn)定性較好，未見脫氟。其油水分配系數(shù)為-1.86，提示為親水性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：注射了18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4的小鼠，在觀察期內(nèi)未見死亡和異常。經(jīng)解剖內(nèi)臟

5、器官未見損傷。病理HE染色示各細(xì)胞形態(tài)與正常對照組細(xì)胞無明顯差異。
　　結(jié)論：合成標(biāo)記前體 NOTA-MAL-Cys39-exendin-4，然后用 Al18F一步法標(biāo)記合成18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4，具備方法簡單、產(chǎn)率高、放化純度高、體外穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，且安全可靠、毒性小，可進(jìn)行細(xì)胞、動物等實(shí)驗(yàn)，易于臨床轉(zhuǎn)化使用。第二部分18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4胰島β細(xì)胞

6、顯像實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：行細(xì)胞攝取和阻斷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 GLP-1R靶向正電子顯像劑18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4與β細(xì)胞是否特異性結(jié)合并計(jì)算結(jié)合率。分析該藥物在大鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布特征，并行microPET顯像驗(yàn)證其進(jìn)行胰島β細(xì)胞顯像的可行性。
　　方法：通過胰腺內(nèi)分泌β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞和外分泌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞與18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4一起培育不同時

7、間，測量計(jì)算各時間兩種細(xì)胞對該藥物的結(jié)合率。另應(yīng)用非放射性標(biāo)記的Cys39-exendin-4對靶點(diǎn)GLP-1R阻斷后，測量兩種細(xì)胞對18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4的結(jié)合率變化。6只小鼠尾靜脈注射各50μCi18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4溶液，分別于注射后不同時間尾尖部取血，然后同樣品管一起進(jìn)行γ計(jì)數(shù)，根據(jù)藥代動力學(xué)軟件DAS2.1.1計(jì)算藥代動力學(xué)參數(shù)。建立正常組、糖尿病

8、組、阻斷組三組（各4只）大鼠模型，注射18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exendin-460 min后行micro PET靜態(tài)顯像，行視覺分析胰腺顯影情況，并ROI半定量分析胰腺、肺、肝臟、腎臟、肌肉組織的放射性分布；顯像結(jié)束后解剖分離各主要器官，并測量該藥物在三組大鼠體內(nèi)的生物分布；最后獲得胰腺病理和免疫組化結(jié)果，與micro PET靜態(tài)顯像對照驗(yàn)證。
　　結(jié)果：INS-1細(xì)胞對18F-NOTA-MAL-Cys39-

9、exendin-4的攝取在60 min左右達(dá)峰，并持續(xù)至120 min，細(xì)胞攝取可被大劑量的Cys39-exendin-4有效阻斷。PANC-1細(xì)胞對18F-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4的攝取隨時間延長持續(xù)增高，120 min達(dá)峰，但其攝取程度一直低于INS-1細(xì)胞。雖然在30min時的細(xì)胞阻斷實(shí)驗(yàn)表明阻斷組與正常組攝取程度有差異，但60min時兩組結(jié)果基本無差異。正常小鼠在尾靜脈靜脈注射18F-Al-NOTA-MA

10、L-Cys39-exendin-4后，血藥濃度迅速下降，分布半衰期t1/2α＝1.786min，消除半衰期t1/2β＝11.557min。18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4 microPET顯像視覺分析結(jié)果示：正常組大鼠胰腺組織可見放射性攝取，而糖尿病組大鼠和阻斷組大鼠胰腺均沒有明顯的放射性攝取。ROI半定量分析顯示：注射藥物60 min后正常組大鼠胰腺組織的放射性攝取值為（1.02±0.15）％ID/g，糖

11、尿病組大鼠胰腺組織的放射性攝取值為（0.23±0.05）%ID/g，阻斷組大鼠胰腺組織的放射性攝取值為（0.21±0.07）%ID/g。正常組和糖尿病組大鼠腎臟組織的放射性濃聚分別為（19.61±2.15）%ID/g和（18.75±3.30）%ID/g，阻斷組大鼠腎臟的放射性濃聚未見明顯受抑，較前兩組略高，
　　攝取值為（21.2±3.19）%ID/g。體外放射性生物分布結(jié)果示18F-Al-NOTA-MAL-Cys39-exend

12、in-4在血液及主要臟器（心臟、肝臟、肌肉、骨骼）中可迅速清除。正常組、糖尿病組和阻斷組大鼠胰腺組織注射百分劑量率分別為（0.97±0.13）%ID/g、（0.22±0.06）%ID/g和（0.20±0.07）%ID/g。HE染色顯示正常組大鼠的胰島細(xì)胞形態(tài)正常，免疫組化染色表明其有豐富的GLP-1R表達(dá)。而糖尿病組大鼠的胰島細(xì)胞萎縮且數(shù)量減少，GLP-1R表達(dá)明顯降低。
　　結(jié)論：細(xì)胞結(jié)合與阻斷實(shí)驗(yàn)證明18F-Al-NOTA-M

13、AL-Cys39-exendin-4可與β細(xì)胞表面的GLP-1R特異性結(jié)合?；铙wmicroPET顯像及體外放射性分布測定結(jié)果表明，由于胰島細(xì)胞的放射性攝取較高，肝、肺等其他器官的放射性攝取較低，所以可以取得較滿意的顯像效果。
　　第三部分18F-PC-10的合成、標(biāo)記與質(zhì)控
　　目的：使用住友 CFN氟多功能合成模塊制備18F-PC-10(N-(4-[18F]Fluorobenzoyl)-N'-{2-[5-(4-fluoro

14、-benzyl)-1-(4-methoxy-benzyl)-4,6-dioxo-1,4,5,6-tetrahydro-
　　[1,3,5]triazin-2-ylamino]-ethyl}-guanidine)，并進(jìn)行質(zhì)量控制分析。
　　方法：通過制備標(biāo)記中間體N-琥珀亞酰胺-4-[18F]氟苯甲酸酯（18F-SFB），將標(biāo)記前體PC-7與中間體18F-SFB在N,N-二異丙基乙胺（DIPEA）的條件下反應(yīng)得到18F-PC-

15、10粗產(chǎn)品，使用半制備HPLC純化獲得產(chǎn)品，除去溶劑后注入生理鹽水得到18F-PC-10注射液。與標(biāo)準(zhǔn)品紫外峰對照，并通過分析型HPLC方法測定放射化學(xué)純度并測定其它質(zhì)量控制指標(biāo)。對 ICR小鼠注射18F-PC-10注射液3.7×107Bq/0.2ml，觀察48h后處死并解剖，觀察各器官受損情況。
　　結(jié)果：半自動化合成18F-PC-10總耗時100~120min，放射化學(xué)合成產(chǎn)率約為(15±3)%（未衰變校正，n=3），放射性化

16、學(xué)純度大于99%（n=3），6h后放射性化學(xué)純度依然
　　大于99%。18F-PC-10注射液呈無色透明狀，pH值6~8之間，分析型HPLC檢測18F-PC-10保留時間為20min。18F-PC-10紫外吸收與標(biāo)準(zhǔn)對照品19F-PC-10保留時間一致。18F-PC-10的血漿蛋白結(jié)合率為25.54%。異常毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示注射了18F-PC-10的小鼠在觀察期內(nèi)未見死亡和異常。解剖后，內(nèi)臟器官未見損傷。病理HE染色示各細(xì)胞形態(tài)與正常

17、對照組細(xì)胞無明顯差異。
　　結(jié)論：基于住友CFN多功能合成模塊的18F-PC-10半自動化合成方法穩(wěn)定，產(chǎn)率較高，放射化學(xué)穩(wěn)定性好，化學(xué)純度高，脂水分配系數(shù)結(jié)果表明18F-PC-10有較強(qiáng)的親脂性，且該藥物安全可靠、毒性小，符合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)使用要求。
　　第四部分18F-PC-10胰島β細(xì)胞顯像的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：驗(yàn)證PROK1R靶向正電子顯像劑18F-PC-10與β細(xì)胞是否特異性結(jié)合，并計(jì)算結(jié)合率；研究該藥物在小鼠體

18、內(nèi)的藥代動力學(xué)表現(xiàn)；并行microPET顯像顯示其生物學(xué)分布特征，驗(yàn)證其進(jìn)行胰島β細(xì)胞顯像的可行性。
　　方法：通過胰腺內(nèi)分泌β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞和外分泌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞與18F-PC-10一起培育不同時間，測量計(jì)算各時間點(diǎn)兩種細(xì)胞對該藥物的結(jié)合率。另應(yīng)用非放射性標(biāo)記的前體PC-7對靶點(diǎn)PROK1R阻斷后，測量兩種細(xì)胞對18F-PC-10的結(jié)合率變化情況。6只小鼠尾靜脈注射各50μCi18F-PC-10溶液，分別于注射后不

19、同時間尾尖部取血，然后同樣品管一起進(jìn)行γ計(jì)數(shù)，根據(jù)藥代動力學(xué)軟件DAS2.1.1計(jì)算藥代動力學(xué)參數(shù)。3只正常小鼠注射18F-PC-10后在5、15、30、60min時各進(jìn)行10min的micro PET靜態(tài)顯像，然后行視覺分析胰腺及體內(nèi)各器官顯影情況，并在各時間段PET圖像上勾畫各器官ROI，計(jì)算放射性分布。
　　結(jié)果：細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果示18F-PC-10與胰腺內(nèi)分泌β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞的結(jié)合率較高，其與胰腺外分泌細(xì)胞PANC-1

20、細(xì)胞的結(jié)合率與INS-1細(xì)胞相似。兩種細(xì)胞的阻斷實(shí)驗(yàn)示阻斷效果并不明顯。藥代動力學(xué)結(jié)果示正常小鼠在尾靜脈注射18F-PC-10后，血藥濃度迅速下降，約10min后血藥濃度下降速率明顯減慢，分布半衰期 t1/2α＝1.419min，消除半衰期t1/2β＝75.338min。小鼠動物實(shí)驗(yàn)示胰腺對18F-PC-10的攝取隨時間延長而下降。在5min時顯影清晰。在隨著腸道放射性攝取逐漸增加，胰腺組織放射性攝取逐漸下降，越來越難以分清輪廓和勾畫測

21、量。從生物學(xué)分布結(jié)果和microPET圖像看，18F-PC-10主要經(jīng)過肝臟進(jìn)行代謝，膽囊、腸道為其主要排泄途徑，泌尿系統(tǒng)為其次要排泄途徑。
　　結(jié)論：細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明18F-PC-10可與β細(xì)胞表面的PROK1R結(jié)合。其藥代動
　　力學(xué)結(jié)果表明該藥物在體內(nèi)清除較慢。生物學(xué)分布結(jié)果表明胰腺對該藥物的攝取較高。進(jìn)行活體microPET顯像示胰腺對該藥物的放射性攝取較高，但受腸道的放射性排泄影響較大，僅在5minPET顯像時可清