Wip1基因敲除對(duì)急性肝損傷的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:肝臟作為人體內(nèi)最大的器官，構(gòu)成體重的2.5％。肝臟的血液供應(yīng)占全部血液循環(huán)的25％，分別通過(guò)門靜脈和肝動(dòng)脈流入肝門，其中前者貢獻(xiàn)了肝臟全部血供的75-80％和全部氧供的＞50％。熱缺血再灌注損傷是臨床中非常常見(jiàn)的急性肝損傷，肝臟手術(shù)中經(jīng)常應(yīng)用的Pringle manoeuvre是造成熱缺血再灌注損傷的主要原因。目前研究發(fā)現(xiàn)，肝臟缺血再灌注損傷受到眾多調(diào)控機(jī)制的共同作用，包括血竇內(nèi)皮細(xì)胞和NO共同介導(dǎo)的血竇內(nèi)壓力改變[1]、Kupf

2、fer細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)[2，3]以及ATP耗竭介導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死和caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在調(diào)控細(xì)胞凋亡、自噬、生長(zhǎng)和再生及蛋白質(zhì)合成方面發(fā)揮重要調(diào)控作用，已有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt激活的下游凋亡和自噬通路調(diào)控肝臟缺血再灌注[8]，同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)Rapamycin抑制mTORC1功能從而激活mTORC2-Akt通路從而減輕肝臟缺血再灌注損傷。Wip1（Wild-type p53 induc

3、ed phosphatase1）是一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，研究發(fā)現(xiàn)其在機(jī)體免疫調(diào)控看、炎癥發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮作用，但目前尚無(wú)研究報(bào)道Wip1在肝臟缺血再灌注過(guò)程中的作用。本研究利用2/3肝臟熱缺血再灌注模型研究wip1基因在急性肝損傷中的作用，并初步探索Wip1對(duì)于肝臟缺血再灌注影響的機(jī)制。
　　方法:
　　1.將129sv背景的wip1基因敲除小鼠和C57BL/6背景的野生型小鼠進(jìn)行雜交，以獲得C57BL/6純合背景的wip

4、1基因雜合小鼠，并進(jìn)一步獲得wip1基因敲除小鼠。
　　2.10～14周齡wip1基因敲除小鼠作為實(shí)驗(yàn)組小鼠，同窩同性別小鼠作為對(duì)照組小鼠，建立2/3肝臟熱缺血再灌注模型，缺血時(shí)間為60min、90min，術(shù)后6h、24h提取小鼠血液和肝臟，測(cè)血清ALT水平，H&E染色觀察組織學(xué)改變，TUNEL染色統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率，Western Blot檢測(cè)肝組織Wip1、Akt、mTOR、p70 S6K、S6蛋白及相應(yīng)磷酸化水平的改變，RT&R

5、eal-time PCR檢測(cè)肝組織wip1基因轉(zhuǎn)錄水平的改變。
　　結(jié)果:
　　1.缺血60min，再灌注6h后，小鼠血清ALT水平分別為:野生型小鼠1172.5±237.1U/L，wip1-/-小鼠851.3±270.9U/L（P＜0.01）;假手術(shù)組小鼠ALT水平分別為:野生型小鼠44.3±11.3U/L，wip1-/-小鼠56.6±12.9U/L（P=0.369）。與同窩對(duì)照野生型小鼠相比，wip1基因敲除小鼠肝臟損傷

6、輕。
　　2.缺血90min，再灌注24h后，小鼠肝組織石蠟切片H&E染色結(jié)果為:野生型小鼠Suzuki評(píng)分為7.75±0.43，wip1-/-小鼠為5.25±0.43(P＜0.01)。與同窩對(duì)照野生型小鼠相比，wip1基因敲除小鼠組織病理學(xué)改變輕。
　　3.缺血90min，再灌注24h后，小鼠肝組織石蠟切片TUNEL染色結(jié)果為:野生型小鼠凋亡率約為62.3％±5.6％，wip1-/-小鼠約為30.4％±3.7％(P＜0.0

7、1)。與同窩對(duì)照野生型小鼠相比，wip1基因敲除小鼠凋亡率低。
　　4.缺血90min，再灌注6h后，野生型小鼠肝組織Wip1蛋白表達(dá)量有所下降;與同窩對(duì)照野生型小鼠相比，wip1-/-小鼠肝組織mTOR、phospho-mTOR(Ser2448)、Akt、S6蛋白水平無(wú)顯著差異，phospho-Akt(Ser473)、phospho-p70S6K(Thr389)蛋白水平明顯升高，phospho-S6(Ser235/236)蛋白水