食管癌中癌睪抗原的表達及MAGE-A3特異性T細胞抗腫瘤作用影響因素的研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在檢測癌睪抗原在食管癌腫瘤組織中的表達并分析其同臨床參數(shù)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MAGE-A3和MAGE-C2在食管癌腫瘤組織中高表達，并同不良預(yù)后相關(guān)。進一步檢測了MAGE-A3特異性CD8+T細胞在食管癌患者外周血中的比例和功能，并分析其比例和功能同食管癌臨床參數(shù)之間的相關(guān)性，證實了PD-1在低反應(yīng)性CD8+T細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞表面高表達，PD-1+CD8+T細胞功能受損，阻斷PD-1/PD-L1通路能夠在一

2、定程度上增加MAGE-A3特異性T細胞的增殖能力和殺傷功能。腫瘤微環(huán)境中能夠產(chǎn)生大量的活性氧，PD-1+CD8+T細胞活性氧的表達水平升高，進一步探討了活性氧清除劑谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷協(xié)同增強T細胞的抗腫瘤效果。
　　第一部分：癌睪抗原在食管癌腫瘤組織中的表達及其臨床意義
　　方法：
　　1)RT-PCR檢測MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2和NY-ESO-1在食管癌腫瘤組織中的表達。

3、>　　2)分析癌睪抗原基因的表達同臨床參數(shù)之間的相關(guān)性。
　　3)免疫組化分析MAGE-A3和MAGE-C2在食管癌組織中的表達并探討同預(yù)后之間的聯(lián)系。
　　4)體外實驗探討MAGE-A3/MAGE-C2對腫瘤細胞系生物學(xué)特性的影響。
　　結(jié)果：
　　1)癌睪抗原在正常組織中不表達，在食管癌腫瘤組織中高表達，并具有較高的陽性率。
　　2)MAGE-A3和MAGE-C2的表達同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期相關(guān)。

4、>　　3)MAGE-A3陽性患者的生存期較MAGE-A3陰性患者生存期差，并能夠作為一個獨立的預(yù)后指標。
　　4)MAGE-A3和MAGE-C2同腫瘤細胞株的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)，下調(diào)MAGE-A3/C2的表達能夠降低腫瘤細胞株的成球能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力，并誘導(dǎo)間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)論：
　　癌睪抗原在食管癌組織中具有較高的陽性率，MAGE-A3的表達可作為一個獨立的預(yù)后指標，通過改變腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腫瘤細胞的成

5、球能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力，并可以作為免疫治療潛在的靶點。
　　第二部分：MAGE-A3抗原特異性T細胞的比例和功能在食管癌患者中的臨床意義
　　方法：
　　1)選擇HLA-A2和MAGE-A3共陽性的患者，體外培養(yǎng)MAGE-A3抗原特異性CD8+T細胞，用MAGE-A3-Tetramer(KVAELVHFL)標記腫瘤抗原特異性T細胞。
　　2)IFN-γ-ELSPOT和PI-AnnexinⅤ雙染法分別檢測了Tetra

6、mer+/CD8+T細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷能力。
　　3)流式檢測Tetramer+/CD8+T細胞的比例，分析MAGE-A3抗原特異性T細胞的比例和功能同臨床資料之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1)MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T細胞在外周血中比例很低(＜0.01％)，經(jīng)負載肽段的DC刺激14d后，Tetramer+/CD8+T細胞的比例均高于0.2％以上。Tetramer+/CD8+T細胞能夠?qū)

7、LA-A2+/MAGE-A3+食管癌細胞株產(chǎn)生特異性殺傷(MAGE-A3抗原特異性CD8+T細胞在體外具有殺傷腫瘤細胞的功能，并能夠分泌CD107a和IFN-γ)。
　　2)Tetramer+/CD8+T細胞的比例與年齡呈正相關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期呈負相關(guān)(P＜0.05)。CD107a的表達水平與臨床預(yù)后不良的參數(shù)呈負相關(guān)（如:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和腫瘤體積）(P＜0.05)。
　　3)功能性Tetramer+/CD8

8、+T細的比例能夠提示患者的預(yù)后。
　　結(jié)論：
　　MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T細胞具有特異性殺傷腫瘤細胞的功能，Tetramer+/CD8+T細胞的功能可作為預(yù)測食管癌預(yù)后的指標，有功能的MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T細胞的比例與患者的生存期呈正相關(guān)。本研究為靶向MAGE-A3抗原的疫苗治療和TCR基因修飾T細胞治療提供理論依據(jù)。
　　第三部分：PD-1在食管癌患者無反應(yīng)性T細胞表面高

9、表達
　　方法：
　　1)流式檢測MAGE-A3抗原特異性CD8+T細胞上PD-1的表達。
　　2)分選CD107a+/IFN-γ+和CD107a-/IFN-γ-MAGE-A3抗原特異性CD8+T細胞，Real-time PCR檢測CD107a+/IFN-γ+和CD107a-/IFN-γ-的MAGE-A3抗原特異性CD8+T細胞PD-1的表達差異。
　　3)流式細胞儀檢測外周血、腫瘤組織和配對正常組織浸潤淋巴細胞

10、表面PD-1的表達，并比較了腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-1+CD8+T細胞和PD-1-CD8+T細胞功能的差異;對比了腫瘤組織和配對正常組織中抗原遞呈細胞和上皮源性細胞表面PD-L1的表達。
　　4)檢測了阻斷PD-1/PD-L1對MAGE-A3特異性CD8+T細胞增殖能力和功能的影響。
　　結(jié)果：
　　1)PD-1在無反應(yīng)性MAGE-A3特異性CD8+T細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞表面高表達。
　　2)PD-L1在腫瘤組

11、織中高表達，腫瘤浸潤淋巴細胞中的PD-1+CD8+T細胞功能受限。
　　3)阻斷PD-1/PD-L1能夠在一定程度上增加MAGE-A3特異性CD8+T細胞的增殖和分泌內(nèi)因子的功能。
　　結(jié)論：
　　食管癌患者腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞表面高表達PD-1，且PD-1+CD8+T細胞功能受限。通過阻斷PD-1/PD-L1能夠一定程度上增加MAGE-A3特異性CD8+T細胞的增殖能力和功能。
　　第四部分：谷胱甘肽聯(lián)合

12、阻斷PD-1/PD-L1通路協(xié)同增強MAGE-A3抗原特異性CD8+T細胞的抗腫瘤效果
　　方法：
　　1)檢測PD-1+/PD-1-CD8+T細胞凋亡的差異和活性氧表達的差異。
　　2)檢測活性氧清除劑谷胱甘肽對T細胞的ROS水平、凋亡和功能的影響。
　　3)體外檢測谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷對CD8+T細胞功能的影響。
　　4)動物實驗檢測在T細胞回輸?shù)幕A(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用谷胱甘肽和PD-1/PD-

13、L1阻斷對食管癌荷瘤小鼠腫瘤生長的影響。
　　5)分離荷瘤小鼠腫瘤組織中的浸潤淋巴細胞，通過流式細胞術(shù)檢測T細胞治療組CD8+在腫瘤部位浸潤的數(shù)目和分泌內(nèi)因子的功能。
　　結(jié)果：
　　1)PD-1+CD8+T細胞較PD-1-CD8+T細胞的ROS水平較高，且凋亡細胞比例明顯高于PD-1-CD8+T細胞。
　　2)谷胱甘肽能夠清除CD8+T細胞的ROS，減少PD-1+CD8+T細胞的凋亡。
　　3)谷胱甘肽聯(lián)

14、合阻斷PD-1/PD-L1協(xié)同增強CD8+T細胞增殖能力和分泌內(nèi)因子的功能。
　　4)在體內(nèi)試驗中，谷胱甘肽能夠協(xié)同增加阻斷PD-1/PD-L1對CD8+T細胞的抗腫瘤的功能，延緩腫瘤的生長。
　　5)谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷能夠增加腫瘤部位浸潤性CD8+T細胞的絕對數(shù)，同時增強其分泌內(nèi)因子的能力。
　　結(jié)論：
　　PD-1+CD8+T細胞具有較高水平的ROS和凋亡比例。谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L

15、1阻斷協(xié)同減少ROS水平和細胞凋亡比例，增強CD8+T細胞增殖能力和分泌內(nèi)因子的功能。谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤作用。
　　結(jié)論：
　　1)癌睪抗原MAGE-A3在食管癌腫瘤組織中具有較高的陽性率，MAGE-A3的表達并可以作為一個獨立評價食管癌預(yù)后的指標。
　　2)MAGE-A3特異性CD8+T細胞能夠特異性殺傷HLA-A2+/MAGE-A3+腫瘤細胞，功能性MAGE-A3特異性CD8+T細