中國(guó)血友病A患者凝血因子Ⅷ抑制物形成的免疫因素研究.pdf

1、血友病A是一種X染色體連鎖的遺傳性出血性疾病,病理機(jī)制為凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷導(dǎo)致FⅧ水平和(或)功能減低而使血液不能正常凝固,臨床主要表現(xiàn)為自發(fā)性關(guān)節(jié)和組織出血,以及出血引致的畸形。血友病患病率約5-10人/10萬,估計(jì)我國(guó)血友病總?cè)藬?shù)10-13萬,其中85％為血友病A。盡管血友病治療在過去30年內(nèi)取得重要進(jìn)展,FⅧ中和抗體(即FⅧ抑制物)的產(chǎn)生仍然是替代治療的一個(gè)重要并發(fā)癥。這種抑制物的產(chǎn)生導(dǎo)致FⅧ替代治療有效性降低,出血相關(guān)并

2、發(fā)癥增加,致殘與致死率升高,經(jīng)濟(jì)與社會(huì)負(fù)擔(dān)明顯增加,為治療帶來了難題,而且目前清除FⅧ抑制物仍然比較困難。J.Wight等的21項(xiàng)前瞻研究顯示1.5年以上累積發(fā)病率一般為20-30％[1]。我們的結(jié)果顯示:中國(guó)血友病患者中位隨訪24月的FⅧ抑制物發(fā)病率為11.6％(25/215),低于歐美等國(guó)家；可能由于經(jīng)濟(jì)水平、FⅧ制劑供應(yīng)問題及診治條件的限制有關(guān),中國(guó)血友病患者FⅧ抑制物發(fā)現(xiàn)年齡較晚(中位年齡25歲),具有高滴度者較少(28％,7/

3、25)等特點(diǎn)]。
　　 盡管國(guó)外學(xué)者已逐漸有許多研究[3,4]證實(shí)FⅧ抑制物是患兒開始接觸外源性FⅧ過程中,環(huán)境因素(如FⅧ暴露情況、FⅧ制品種類、免疫激活事件等)和遺傳因素(FⅧ基因突變類型、免疫調(diào)節(jié)分子基因多態(tài)性)相互復(fù)雜作用共同作用于免疫系統(tǒng)而產(chǎn)生,但有關(guān)FⅧ抑制物產(chǎn)生的免疫機(jī)制,目前仍有爭(zhēng)議。國(guó)外嘗試一些預(yù)防FⅧ抑制物形成措施,但國(guó)外模式未必適用于中國(guó)。為此,我們擬通過比較中國(guó)和歐美等國(guó)家患者FⅧ抑制物特征,尋找我國(guó)患者

4、FⅧ抑制物發(fā)病率與歐美發(fā)達(dá)國(guó)家存在差異的可能因?yàn)椋晃覀冋n題組已經(jīng)完成了在我國(guó)治療狀況下患者FⅧ抑制物形成與FⅧ暴露情況等環(huán)境因素的分析,以及FⅧ基因突變類型與免疫調(diào)節(jié)分子基因多態(tài)性等遺傳因素的研究。結(jié)果顯示:中國(guó)血友病患者中位隨訪24月的FⅧ抑制物發(fā)病率為11.6％(25/215),低于歐美等國(guó)家。主要是因?yàn)榄h(huán)境因素導(dǎo)致,遺傳因素?zé)o明顯差異。
　　 盡管替代治療過程中抑制物產(chǎn)生的免疫反應(yīng)的基本機(jī)理已經(jīng)闡明,但是還有許多關(guān)于免疫機(jī)

5、制的重要的問題仍未解決,更清楚的理解免疫相關(guān)機(jī)制對(duì)于避免抑制物產(chǎn)生,誘導(dǎo)FⅧ免疫耐受,甚至是基因治療的成功進(jìn)行是至關(guān)重要的。因此,我們進(jìn)一步對(duì)免疫因素(淋巴細(xì)胞亞群、CD4+T淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌等)進(jìn)行研究,分析免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的差異,探討符合我國(guó)國(guó)情的FⅧ抑制物產(chǎn)生危險(xiǎn)性的分層預(yù)測(cè)方法。這將為探討干涉或減少FⅧ抑制物形成的策略,以及尋找治療FⅧ抑制物的新方法提供依據(jù),對(duì)于抑制物形成的防治具有一定的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。
　　

6、 方法：
　　 一、中國(guó)血友病A患者淋巴細(xì)胞亞群分析
　　 1.病例篩選:從南方醫(yī)院血友病中心(即廣東省血友病信息管理中心)登記的,既往抑制物陽(yáng)性患者進(jìn)行復(fù)查,選取15例FⅧ抑制物陽(yáng)性患者,同時(shí)選取9例來自血友病中心的FⅧ抑制物陰性血友病A患者作為對(duì)照組。
　　 2.淋巴細(xì)胞亞群分析:取外周靜脈血2ml,肝素抗凝,采用流式細(xì)胞儀技術(shù)分析淋巴細(xì)胞亞群,包括CD4+Tcells,CD8+Tcells,NKTcells

7、,CD4+CD25+Tcells,CD4+FoxP3+Tcells等。
　　 二、中國(guó)血友病A患者CD4+T淋巴細(xì)胞體外FⅧ刺激增殖分析
　　 1.病例:血友病A抑制物陽(yáng)性患者14例,抑制物陰性患者6例作為對(duì)照。
　　 2.抽取肝素抗凝外周血10ml。采用淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單個(gè)核細(xì)胞,磁珠分選去除CD8+T淋巴細(xì)胞,獲得CD4+T淋巴細(xì)胞富集的細(xì)胞,于96孔板內(nèi)進(jìn)行體外培養(yǎng),加rhFⅧ刺激,并設(shè)空白對(duì)照組和

8、PHA對(duì)照組。37℃,5％CO2培養(yǎng)72小時(shí)后,加CCK-8,繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí),測(cè)450nm吸光度(OD值),計(jì)算增殖。
　　 三、中國(guó)血友病A患者體外FⅧ刺激細(xì)胞因子分泌檢測(cè)
　　 1.病例:選擇抑制物陽(yáng)性患者12例,抑制物陰性患者6例作為對(duì)照。
　　 2.將第二部分CD4+T細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)的上清,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)IL-4、IFN-γ和TGF—β分泌情況。
　　 結(jié)果：
　　

9、1.1抑制物陽(yáng)性組與抑制物陰性組之間各淋巴細(xì)胞亞群(CD4+/CD3+T細(xì)胞、CD8+/CD3+T細(xì)胞、CD45RA+/CD4+T細(xì)胞、CD45RO+CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,比例在正常值范圍內(nèi)。CD4+/CD8+比值,抑制物陽(yáng)性組為(1.41±0.63),抑制物陰性組為(1.90±0.60),t=1.871,P=0.933,抑制物陽(yáng)性組低于抑制物陰性組,但是兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 1.2 Treg細(xì)胞:抑

10、制物陽(yáng)性組 Treg比例低于抑制物陰性組,但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD25+/CD4+T細(xì)胞在血友病A抑制物陽(yáng)性組與陰性組比例分別為2.56±1.63％和3.48±2.10％,t=1.214,P=0.866; PoxP3+T細(xì)胞抑制物陽(yáng)性組和陰性組比例分別為3.97±2.50％和5.24±2.94％,t=1.123,P=0.458；PoxP3+/CD25+T細(xì)胞抑制物陽(yáng)性組和陰性組比例分別為0.80±0.80％和0.97±0.70％,

11、t=0.524,P=0.730:PoxP3+/CD4+T細(xì)胞抑制物陽(yáng)性組和陰性組比例分別為1.90±1.19％和2.36±1.23％,t=0.912,P=0.919。
　　 2.1.磁珠分選后,陰性部分標(biāo)抗體用流式細(xì)胞儀檢測(cè),CD8+T細(xì)胞殘余量為1.96-5.16％。
　　 2.2.FⅧ刺激后,抑制物陽(yáng)性組增殖比率為(0.78±0.71),抑制物陰性組增殖比率為(0.26±0.29),,t=-1.718,P=0.025

12、。
　　 3.1血友病A患者CD4+T淋巴細(xì)胞體外FⅧ刺激后,IL-4分泌量抑制物陽(yáng)性組為(146.91±19.74)ng/ml,抑制物陰性組為(128.65±30.13)ng/ml,t=-1.555,P=0.222。
　　 3.2血友病A患者CD4+T淋巴細(xì)胞體外FⅧ刺激后,IFN-γ分泌量抑制物陽(yáng)性組為(18.08±11.85)ng/ml,抑制物陰性組為(16.16±9.35)ng/ml,t=-0.345,P=0.5

13、80。
　　 3.3血友病A患者CD4+T淋巴細(xì)胞體外FⅧ刺激后,TGF-β分泌量分別為抑制物陽(yáng)性組(86.79±9.42)ng/ml,抑制物陰性組(91.86±6.24)ng/ml,t=1.185,P=0.620。
　　 結(jié)論：
　　 1.1血友病FⅧ抑制物陽(yáng)性患者與抑制物陰性患者,各淋巴細(xì)胞亞群在正常范圍。
　　 1.2血友病FⅧ抑制物陽(yáng)性與陰性患者相比,Treg細(xì)胞比例有減低趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。<