參與DNA損傷應(yīng)答lncRNA的鑒定及其功能的初步研究.pdf

1、在生物體內(nèi)，維持基因組的穩(wěn)定性是細(xì)胞正常生存的必要條件。然而，有許多外源因素和內(nèi)源因素會(huì)造成DNA的斷裂，如細(xì)胞代謝產(chǎn)物、UV和電離輻射等。為維持基因組的穩(wěn)定性，機(jī)體進(jìn)化出了高度保守的應(yīng)答體系，稱之為DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response，DDR)。DNA損傷應(yīng)答過程包括DNA損傷位點(diǎn)的識(shí)別、招募DNA修復(fù)復(fù)合物到DNA損傷位點(diǎn)、修復(fù)受損的DNA、激活細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)以及誘發(fā)凋亡[1]，DNA損傷應(yīng)答對(duì)多個(gè)細(xì)胞進(jìn)程都有廣泛

2、的影響。為確保足夠的時(shí)間完成精確有效的DNA損傷修復(fù)，細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激活并使細(xì)胞周期阻滯。同時(shí)，細(xì)胞也將激活一些基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因包括DNA損傷修復(fù)和調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因。最近研究表明，不僅蛋白編碼基因，非編碼的基因也在維護(hù)基因組穩(wěn)定性過程中起到重要作用[1-3]。其中長鏈非編碼RNA(long non coding RNA,lncRNA)是一類由RNA聚合酶Ⅱ產(chǎn)生，長度大于200bp的RNA,它們的表達(dá)量低，保守性低，且具有組織特異

3、性。當(dāng)DNA損傷后，DDR相關(guān)lncRNA會(huì)在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及RNA降解水平被調(diào)控。同樣的，lncRNA也可以靶向DDR相關(guān)的基因調(diào)控其表達(dá)。lncRNA可以作為信號(hào)、誘餌、導(dǎo)引、支架調(diào)控基因表達(dá)。近幾年來，雖然已經(jīng)在lncRNA維護(hù)基因組穩(wěn)定性方面做過很多研究，識(shí)別了許多參與DNA損傷應(yīng)答的lncRNA，但lncRNA如何參與DNA損傷應(yīng)答以及它們的應(yīng)答機(jī)制仍然是未知的。
　　在來自清華大學(xué)高冠軍教授實(shí)驗(yàn)室的大力支持下，

4、獲得了43株lncRNA敲除的果蠅株。為研究參與DNA損傷應(yīng)答的lncRNA，采用在輻照后統(tǒng)計(jì)生存率和染色體斷裂數(shù)目的方法，對(duì)43株lncRNA敲除果蠅株進(jìn)行了DNA損傷敏感性的檢測(cè)，獲得了12株具有DNA損傷敏感性的IncRNA敲除果蠅株，初步認(rèn)為這12個(gè)lncRNA可能參與DNA損傷應(yīng)答。為系統(tǒng)性的篩選出更多參與DNA損傷應(yīng)答的lncRNA，采用了高通量測(cè)序技術(shù)，使用野生型w1118果蠅、p53突變果蠅、e2f1突變果蠅的三期幼蟲，

5、在生理?xiàng)l件和輻照條件下，獲得了242個(gè)差異表達(dá)的lncRNA。此外，在43株IncRNA敲除果蠅株里面，CR43356在RNA測(cè)序結(jié)果中出現(xiàn)了差異表達(dá)。DNA損傷敏感性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明，CR43356敲除果蠅株對(duì)DNA損傷高度敏感。通過查找FlyBase網(wǎng)站信息，發(fā)現(xiàn)CR43356主要在果蠅三期幼蟲的翅膀胚芽組織中表達(dá)。為進(jìn)一步探究CR43356參與DNA損傷應(yīng)答的機(jī)制，對(duì)CR43356果蠅進(jìn)行了G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)檢測(cè)和凋亡檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CR4