負(fù)壓封閉引流減輕肢體骨骼肌缺血再灌注損傷及其相關(guān)肺損傷機制的研究.pdf

1、缺血再灌注（Ischemia Reperfusion，I/R）指器官或組織在血供中斷或受限后重新恢復(fù)血供的病理過程。缺血的組織/器官在血供恢復(fù)、缺氧解除后，表現(xiàn)出較缺血階段更劇烈的炎癥反應(yīng)和組織/器官損傷，稱為缺血再灌注損傷（Ischemia and Reperfusion Injury，IRI）。骨骼肌缺血再灌注損傷見于創(chuàng)傷、外科手術(shù)及其它疾病，肢體/軀干部位擠壓傷可以導(dǎo)致嚴(yán)重的骨骼肌缺血再灌注損傷，甚至還會引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征、急

2、性肺損傷甚至多器官功能衰竭。負(fù)壓封閉引流（Vacuum SealingDrainage，VSD）廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷等各外科領(lǐng)域，可以減輕局部創(chuàng)傷組織水腫和炎癥反應(yīng)，增加組織血流灌注，并可降低全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官衰竭的發(fā)生率。本研究論文擬通過臨床觀察，分析合并血管損傷的下肢開放性骨折病人使用VSD治療的效果及安全性；并通過試驗研究探討VSD減輕骨骼肌缺血再灌注損傷及其相關(guān)肺損傷的作用機制。
　　1.臨床研究
　　目的:臨床研

3、究部分主要觀察負(fù)壓封閉引流治療下肢擠壓伴開放性骨折合并血管損傷病人的安全性和臨床療效。方法:搜集我院創(chuàng)傷外科2014年1月至2015年12月所有合并血管損傷的嚴(yán)重下肢開放性骨折病人的病例資料，按照急診術(shù)后是否以VSD覆蓋創(chuàng)口分為VSD治療組及非VSD治療組，比較兩組病人急診術(shù)前肢體缺血時間、截肢評分、急診術(shù)后血管痙攣、栓塞、出血等并發(fā)癥例數(shù)，再次血管探查，創(chuàng)口感染，急性肺損傷，截肢例數(shù)，創(chuàng)口閉合時間和植皮/皮瓣例數(shù)，以及血清CRP、IL

4、-6和肌紅蛋白濃度，分析負(fù)壓封閉引流對該類病人的治療效果。結(jié)果兩組病人急診術(shù)前的缺血時間，截肢評分，血清CRP，IL-6和肌紅蛋白以及術(shù)后血管痙攣、栓塞、出血等并發(fā)癥發(fā)生率比較無差異；VSD治療組急診術(shù)后再次血管探查手術(shù)率，創(chuàng)口感染率，急性肺損傷發(fā)生率均低于非VSD治療組；VSD治療組傷后創(chuàng)口閉合時間也少于非VSD治療組且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在治療72小時后，VSD組患者血清CRP，IL-6以及肌紅蛋白水平均低于非VSD

5、治療組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P<0.05）。結(jié)論負(fù)壓封閉引流治療并發(fā)血管損傷的下肢開放性骨折創(chuàng)口，并不增加吻合血管痙攣、栓塞及出血的發(fā)生率，且可以減少創(chuàng)口閉合時間，促進(jìn)創(chuàng)口愈合，減輕全身炎癥反應(yīng)，但負(fù)壓封閉引流是否能減輕骨骼肌缺血再灌注損傷，還有待進(jìn)一步試驗研究的驗證。
　　2.實驗研究
　　目的研究負(fù)壓封閉引流減輕肢體骨骼肌缺血再灌注損傷及其相關(guān)肺損傷的機制。方法試驗研究部分選用雄性Sprague Dawley大鼠建立

6、后肢骨骼肌缺血再灌注損傷動物模型，通過夾閉和開放股動脈實現(xiàn)大鼠左后肢缺血4小時、再灌注8小時。試驗動物分為假手術(shù)對照組，缺血/再灌注（I/R）損傷模型組，負(fù)壓封閉引流干預(yù)的缺血/再灌注損傷模型組（I/R+VSD組），每組12只。各實驗組隨機選取6只大鼠，利用伊文思藍(lán)法測定肺毛細(xì)血管滲漏情況。各組其余模型用于以下檢測：①檢測大鼠左后肢腓腸肌組織氧分壓；②測定骨骼肌和肺組織的濕重/干重比；③骨骼肌細(xì)胞活性 MTT法測定；④骨骼肌組織氧化應(yīng)激

7、指標(biāo)（SOD、MDA、CAT、GSH）濃度的測定；⑤骨骼肌MPO濃度測定；⑥骨骼肌血管內(nèi)皮生長因子測定；⑦骨骼肌、肺和血清中炎癥因子IL-1?、IL-6、TNF-α濃度測定；⑧骨骼肌和肺組織病理學(xué)評估分別采用HE染色，骨骼肌組織HMGB1蛋白免疫組化染色以及Tunel法制片，用于觀察組織形態(tài)、HMGB1蛋白表達(dá)（定性）和定位、細(xì)胞凋亡情況等；⑨在基因水平（mRNA）和蛋白水平分別檢測骨骼肌、肺、血清中炎癥相關(guān)蛋白HMGB1表達(dá)的情況。所

8、有數(shù)據(jù)用SPSS19軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式進(jìn)行表述，統(tǒng)計分析前先驗證數(shù)據(jù)正態(tài)性及方差齊性，三個試驗組組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法（方差齊）或Tamhane’s T2法（方差不齊），氧分壓數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果①伊文思藍(lán)測定 VSD組大鼠肺毛細(xì)血管滲漏程度低于I/R組（t=5.289 P<0.001），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。②缺血再灌注后使用VSD組

9、干預(yù)組大鼠的骨骼肌組織氧分壓在再灌注初期顯著低于I/R組（P<0.05），且再灌注后氧分壓穩(wěn)定在較低水平，有利于抑制需要氧分子參與的氧化應(yīng)激反應(yīng)。③VSD組大鼠骨骼肌和肺部組織的濕重/干重比顯著低于I/R組（t=7.718 P<0.001；t=4.427 P<0.001），說明VSD組大鼠骨骼肌和肺組織水腫程度低于I/R組。④MTT結(jié)果顯示VSD骨骼肌細(xì)胞的活性顯著高于I/R組（t=3.059 P=0.006）。⑤氧化應(yīng)激時組織過氧化損

10、傷產(chǎn)物MDA在VSD組的濃度水平顯著低于I/R組（t=2.212 P=0.043），而VSD組的抗氧化因子SOD、CAT和GSH的水平明顯高于I/R組，差異顯著（t=2.492 P=0.025；t=2.264 P=0.039；t=2.424 P=0.028）。⑥炎癥指標(biāo)MPO在VSD組的濃度低于I/R組，差值具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.145 P=0.049）。⑦VEGF在 I/R組和 VSD組的表達(dá)水平較對照組顯著增高（F=77.616

11、P<0.001），且VSD組升高程度顯著大于I/R組（t=7.459 P<0.001）。⑧炎癥因子IL-1?、IL-6、TNF-α濃度水平的顯著差異表現(xiàn)為VSD組低于I/R組（P<0.05）。⑨骨骼肌HE染色切片顯示VSD組組織細(xì)胞間隙比例與排列情況接近正常組織，而I/R組骨骼肌細(xì)胞表現(xiàn)為肌纖維變性，肌細(xì)胞間隙增寬，炎癥細(xì)胞浸潤，兩組骨骼肌損傷評分差異顯著（t=6.198 P<0.001）；肺組織HE切片則表現(xiàn)為VSD組的炎癥細(xì)胞浸潤、

12、水腫和滲出的程度低于I/R組，兩組肺部損傷評分差異顯著（t=6.033 P<0.001）；免疫組化結(jié)果顯示，損傷相關(guān)蛋白HMGB1在VSD組骨骼肌中的表達(dá)明顯低于I/R組；Tunel檢測結(jié)果表明骨骼肌缺血再灌注損傷后局部組織細(xì)胞發(fā)生了凋亡，而VSD的干預(yù)可明顯降低骨骼肌組織發(fā)生凋亡細(xì)胞的比例，表現(xiàn)為與/IR組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.177P<0.001）。⑩熒光定量PCR結(jié)果和免疫蛋白印跡Western Blot結(jié)果顯示，HBG

13、B1在VSD組的骨骼肌和肺組織的基因表達(dá)水平、蛋白表達(dá)水平均低于I/R組，差異顯著（P<0.05）；ELISA法測定血清 HMGB1的結(jié)果也表現(xiàn)出相同的變化。結(jié)論持續(xù)負(fù)壓封閉引流，可以移除骨骼肌組織間隙內(nèi)多余的液體，減輕水腫，增加毛細(xì)血管血流灌注，負(fù)壓封閉引流降低了再灌注后骨骼肌組織的氧分壓和炎癥因子，減輕了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的程度，繼而改善了缺血再灌注引起的骨骼肌組織水腫、肌纖維變形、壞死，肌細(xì)胞活性下降和細(xì)胞凋亡；負(fù)壓封閉引流減輕骨

14、骼肌缺血再灌注損傷，降低血漿炎癥因子，移除可以導(dǎo)致急性肺損傷的損傷相關(guān)蛋白分子 HMGB1蛋白，繼而減輕全身炎癥反應(yīng)和急性肺損傷。
　　綜上，負(fù)壓封閉引流應(yīng)用于并發(fā)血管損傷的下肢開放性骨折病人，可以促進(jìn)創(chuàng)口愈合，減輕全身炎癥反應(yīng)，一定程度減少創(chuàng)口感染和急性肺損傷的發(fā)生率，使病人受益。通過動物試驗可知，負(fù)壓封閉引流通過降低骨骼肌組織氧分壓，減輕骨骼肌氧化應(yīng)激損傷；通過減輕組織水腫，增加骨骼肌血流灌注，緩解骨骼肌缺血再灌注時的“無復(fù)流