蛋白二硫鍵異構酶和淀粉合成酶基因沉默對水稻耐熱及結實特性的影響.pdf

1、高溫脅迫是制約水稻產量潛力發(fā)揮和品質穩(wěn)定的主要逆境因素之一，它對水稻產量和品質形成的影響作用，與水稻“庫”、“源”器官中的碳、氮代謝過程存在著密切聯(lián)系。本實驗室的前期研究工作表明，蛋白二硫鍵異構酶基因(PDI)、可溶性淀粉合成酶的SSSⅠ和SSSⅢa基因，不僅是水稻“庫”器官中的貯藏蛋白積累和淀粉合成途徑的重要調控基因，而且對高溫脅迫的響應也表現(xiàn)較敏感，可能是高溫脅迫對稻米品質形成及其優(yōu)劣產生影響的幾個重要功能基因位點。為此，本文構建了

2、淀粉合成酶SSSⅠ和SSSⅢa基因的RNAi沉默載體，以及PDI基因的RNAi沉默和超表達載體，并通過轉化日本晴的愈傷組織，獲得其轉基因水稻植株，在此基礎上，結合水稻在不同生育時期的高溫脅迫試驗，對上述基因沉默或超表達后的有關生理生態(tài)特征及相關基因的表達模式進行了研究分析。主要研究結果如下:
　　 1.以野生日本晴的發(fā)育籽粒為材料，通過PCR法克隆了PDI基因保守區(qū)450bp大小的靶標序列作為干擾區(qū)段，構建了含有內含子hpRNA

3、(ihpRNA)的雙元表達載體pTCK303-RiOsPDI，經農桿菌介導轉化日本晴，獲得8株轉基因植株;通過在T0代對其潮霉素(Hyg)抗性基因的PCR鑒定及Southern雜交檢測，確證攜帶有干擾片段的T-DNA區(qū)已整合到水稻基因組中，且在轉基因T1代符合3∶1的分離模式;半定量RT-PCR和熒光定量PCR的檢測結果表明，PDI基因沉默轉基因陽性植株不同器官中的PDI表達量均顯著降低，尤其是其籽粒中的PDI表達量較微，幾乎能引起靶基

4、因80％左右的沉默;對轉基因T2代植株的高溫結實特性和籽粒理化品質的檢測結果表明，PDI基因沉默會引起水稻的耐熱性顯著下降，在高溫脅迫處理下的結實率大幅度降低，但其在常溫處理下的結實率與對照之間無顯著差異。此外，PDI基因沉默后，稻米的透明度下降、堊白度有所增加，但對籽粒粗蛋白總量和直鏈淀粉含量的影響不甚明顯。
　　 2.以PCR法從日本晴發(fā)育胚乳中克隆了水稻PDI基因編碼區(qū)(coding sequence region,CDS

5、)，目標片段為1631bp，包含了PDI基因的全表達序列，構建了Ubiquitin啟動子驅動的超表達載體pTCK303-OsPDI，并轉化日本晴成熟胚的愈傷組織，獲得有9株轉基因陽性植株，T1代半定量RT-PCR檢測結果顯示，PDI基因沉默后，其幼苗器官中的PDI表達量顯著低于其野生對照植株，而PDI基因的超表達則存在相反效果，表現(xiàn)出其抑制或促進PDI基因表達的效果;水稻苗期的高溫生態(tài)試驗結果揭示，PDI基因在高溫脅迫下呈上調表達，但持

6、續(xù)高溫脅迫會引起PDI基因表達量的下降，但Bip基因在高溫脅迫前期的表達量較低，隨著處理時間的延長，其相對表達量大幅升高，與PDI基因呈“此消彼長”的變化趨勢，兩者可能在水稻抵御高溫脅迫響應過程中起“互補”作用。
　　 3.利用PCR法分別克隆了水稻淀粉合成酶基因SSSⅠ和SSSⅢa保守區(qū)399bp和389bp大小的靶標序列作為干擾區(qū)段，分別構建了含有內含子hpRNA(ihpRNA)的雙元表達載體pTCK303-RiOsSSSⅠ

7、和pTCK303-RiOsSSSⅢa，轉化日本晴后，分別獲得了12株和13株SSSⅠ和SSSⅢa基因沉默的陽性植株。半定量RT-PCR分析結果顯示，SSSⅠ和SSSⅢa基因沉默后， T1代轉基因植株苗期葉片中的SSSⅠ或SSSⅢa基因在常溫下表達量均顯著低于其對照植株，分別都起到了較明顯的干擾效果，而其他同工型基因（如SSSⅡb、SSSⅢb、SSSⅣa、SSSⅣb）的表達水平并未受明顯影響;在高溫脅迫下，SSSⅠ基因RNAi沉默植株可溶