大豆疫霉三個(gè)效應(yīng)子調(diào)控植物免疫反應(yīng)的功能與機(jī)制研究.pdf

1、大豆疫霉引起的大豆根腐病是世界范圍內(nèi)大豆生產(chǎn)上的一種毀滅性病害。大豆疫霉隸屬于卵菌，該類病原菌雖然在形態(tài)上與真菌相似，但在進(jìn)化上卻和硅藻及藍(lán)藻關(guān)系較近，為茸鞭生物界，因此一般真菌殺菌劑往往對大豆疫霉和其它卵菌無效;同時(shí)在自然界中由效應(yīng)子介導(dǎo)的病原菌快速進(jìn)化使得抗病品種很快就會(huì)被新病原菌克服，因此防治該病害是大豆生產(chǎn)中的一個(gè)重要難題。植物與病原菌互作過程中，植物通過先天免疫系統(tǒng)能夠抵抗大部分病原菌的侵染，同時(shí)病原菌為了成功侵染植物，會(huì)分泌

2、許多效應(yīng)子來調(diào)控植物的免疫。效應(yīng)子可以抑制植物的免疫促進(jìn)病原菌的侵染，發(fā)揮毒性功能，同時(shí)有些效應(yīng)子也可能被植物的抗病蛋白識別誘發(fā)植物的免疫，這些效應(yīng)子表現(xiàn)出無毒功能。通過效應(yīng)子研究病原菌的致病及與植物的互作機(jī)制在理論上有助于理解病原菌的致病成災(zāi)規(guī)律，在實(shí)踐上有助于抗病品種的開發(fā)和布局。因此本文對大豆疫霉中的三個(gè)胞內(nèi)效應(yīng)子PsCRN108、PsIsc1、Avr1k在病原菌侵染過程中的功能進(jìn)行了分析，并探完了其可能的分子機(jī)制，獲得的主要結(jié)果

3、與結(jié)論如下:
　　效應(yīng)子PsCRN108通過結(jié)合寄主DNA來抑制植物HSP基因的誘導(dǎo)表達(dá)和植物的免疫反應(yīng)。本文通過對效應(yīng)子序列預(yù)測鑒定到三個(gè)具有Helix-hairpin-Helix結(jié)構(gòu)域的CRN效應(yīng)子，其中只有PsCRN108基因在侵染階段上調(diào)表達(dá)且為真基因，表明其可能與毒性相關(guān)。PsCRN108的信號肽能夠?qū)⑥D(zhuǎn)化酵素分泌到酵母細(xì)胞外，表明其為分泌蛋白。它的全長蛋白能夠?qū)vr1b效應(yīng)子的C端功能域轉(zhuǎn)運(yùn)到寄主細(xì)胞，說明它是一個(gè)在

4、植物細(xì)胞中起作用的效應(yīng)子。定位實(shí)驗(yàn)顯示，在侵染過程中它定位在吸器，在植物細(xì)胞中它定位在細(xì)胞核。上述實(shí)驗(yàn)證明PsCRN108效應(yīng)子在侵染時(shí)通過病原菌吸器分泌并轉(zhuǎn)運(yùn)到寄主細(xì)胞核中起作用。該效應(yīng)子編碼基因沉默后，病原菌致病力下降，并且不能抑制大豆胼胝質(zhì)的沉積。在擬南芥和煙草中表達(dá)PsCRN108能顯著降低植物對辣椒疫霉P.capsici的抗性，表明它是一個(gè)能抑制植物免疫反應(yīng)的毒性效應(yīng)子。對轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行DGE測序分析發(fā)現(xiàn)，PsCRN108轉(zhuǎn)

5、基因植株中大量HSP基因的轉(zhuǎn)錄水平下降，在煙草和大豆中PsCRN108也能抑制HSP基因的誘導(dǎo)表達(dá)。煙草中沉默Hsp90降低了植物對辣椒疫霉的抗性，表明煙草中的Hsp90對植物抵抗疫霉菌起到非常重要的作用。進(jìn)一步的研究表明， PsCRN108能夠結(jié)合HSP基因的啟動(dòng)子及其保守元件，結(jié)合后能抑制植物內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA1a與HSP啟動(dòng)子的結(jié)合及其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。突變體分析顯示，PsCRN108的HhH結(jié)構(gòu)域和核定位信號對于其毒性功能和

6、HSP基因的轉(zhuǎn)錄抑制具有重要作用，而HhH結(jié)構(gòu)域?qū)τ贒NA結(jié)合為必需。綜合上述結(jié)果，我們認(rèn)為大豆疫霉效應(yīng)子PsCRN108能結(jié)合寄主的HSP基因啟動(dòng)子，抑制植物內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合和HSP基因的轉(zhuǎn)錄，從而干擾HSP蛋白介導(dǎo)的植物免疫反應(yīng)，該發(fā)現(xiàn)為卵菌中首次鑒定到的能靶向寄主DNA的效應(yīng)子。
　　一個(gè)非典型分泌大豆疫霉效應(yīng)子PsIsc1水解植物水楊酸的合成前體。植物產(chǎn)生的水楊酸在植物抵抗病原菌中起重要作用，該化合物在植物中通過

7、兩條途徑合成，其中一條經(jīng)由異分支酸。本文從大豆疫霉中鑒定到1個(gè)編碼異分支酸水解酶的基因PsIsc1，該基因編碼的酶能水解異分支酸生成2，3-二氫-2，3-二羥基苯甲酸甲酯(DDHB)和丙酮酸鹽，推測它有可能在植物細(xì)胞中降解水楊酸的合成前體異分支酸，來抑制水楊酸的合成及其介導(dǎo)的抗性。本文對該推測進(jìn)行了系統(tǒng)的驗(yàn)證和研究。PsIsc1在侵染階段上調(diào)表達(dá)，沉默該基因后病原菌致病能力下降，表明它在大豆疫霉的致病過程中起重要作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因沉默

8、后，侵染大豆組織中水楊酸含量增加并且PR1基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，表明PsIsc1可能影響植物水楊酸含量。定位實(shí)驗(yàn)表明，PsIsc1效應(yīng)子在侵染時(shí)通過病原菌吸器分泌，能轉(zhuǎn)運(yùn)到寄主細(xì)胞中起作用。在植物中表達(dá)PsIsc1后，植物水楊酸含量降低、PR1基因的轉(zhuǎn)錄下降、植物抗病力也隨之減弱。結(jié)合體外生化實(shí)驗(yàn)和突變體實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PsIsc1具有水解異分支酸的活性，并且該活性與其抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)功能相關(guān)。更重要的是發(fā)現(xiàn)該蛋白不具有信號肽，但能分泌到胞外，且具有

9、非典型分泌特征，因此我們將其定義為非典型分泌效應(yīng)子。上述結(jié)果表明，大豆疫霉的效應(yīng)子PsIsc1可以在寄主細(xì)胞中分解植物水楊酸合成的前體，降低植物水楊酸的含量;該效應(yīng)子通過非典型分泌系統(tǒng)分泌，為植物病原菌中一類新型效應(yīng)子。
　　大豆疫霉中兩個(gè)無毒基因Avr1b-1和Avr1k能同時(shí)被寄主的Rps1k基因識別。Rps1k是大豆生產(chǎn)上應(yīng)用最為廣泛的一個(gè)抗病基因，本文在大豆疫霉中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)效應(yīng)子Avr1b-1和Avr1k都能夠被大豆的抗病基

10、因Rps1k識別。在大豆中瞬時(shí)表達(dá)Avr1b-1以及在Avr1b-1的毒性大豆疫霉菌株中穩(wěn)定表達(dá)Avr1b-1，都能夠使Avr1b-1被Rps1k識別而觸發(fā)Rps1k介導(dǎo)的抗性;而Avr1b-1的無毒菌株中沉默Avr1b-1，則使該菌株不能被Rps1k識別，也不能觸發(fā)Rps1k介導(dǎo)的抗性;這就說明Avr1b-1可以被Rps1k識別從而觸發(fā)Rps1k介導(dǎo)的抗性。我們在一些不表達(dá)Avr1b-1卻仍然對Rps1k無毒的菌株中鑒定到另一個(gè)RxL

11、R效應(yīng)子Avr1k，它與Avr1b-1在基因組中的位置僅相距5kb。在Avr1k的毒性菌株中表達(dá)Avr1k基因，能使該菌株觸發(fā)Rps1k介導(dǎo)的抗性;而在Avr1k的無毒菌株中沉默Avr1k基因，則使該菌株喪失誘導(dǎo)Rps1k介導(dǎo)的抗性的能力。上述結(jié)果表明，大豆疫霉中的兩個(gè)RxLR無毒基因都能夠被寄主的Rps1k基因識別產(chǎn)生抗性;這兩個(gè)效應(yīng)子在進(jìn)化上很難同時(shí)丟失，這從理論上解釋了大豆Rps1k基因在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的原因。
　　效應(yīng)子進(jìn)