血管緊張素-Ⅱ預(yù)處理的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)皮膚全層組織缺損性創(chuàng)面愈合的機制研究.pdf

1、目的:
　　人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells， hUCMSCs）作為一種較新型的 MSCs，其移植對于各類損傷的組織器官有良好的修復(fù)作用，因此也成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點之一。但研究發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs移植后會受到機體內(nèi)環(huán)境的影響，生物學(xué)特性發(fā)生改變，進(jìn)而影響其修復(fù)效果。那么，如何能夠處理hUCMSCs，使其更適應(yīng)機體內(nèi)環(huán)境，發(fā)揮更好的組織修復(fù)作用是近來的研究

2、熱點，也是本研究的重點。損傷組織局部微環(huán)境中RAS系統(tǒng)的激活致使血管緊張素-II（Angiotensin-II，Ang-II）持續(xù)生成，影響著內(nèi)、外源性MSCs的生物學(xué)活性及功能。有研究表明，高濃度Ang-II可誘導(dǎo)MSCs、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelia cells，HUVEC）等多種細(xì)胞發(fā)生損傷、凋亡、甚至死亡，而低濃度Ang-II預(yù)處理MSCs后，則可顯著提高其耐缺氧能力，促進(jìn)多種

3、細(xì)胞因子的分泌。在旁分泌的多種細(xì)胞因子中，血管內(nèi)皮細(xì)胞因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是含量較高且發(fā)揮修復(fù)治療作用的關(guān)鍵因子，其通過與特異性受體（VEGFR2）結(jié)合，激活下游信號而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡、促細(xì)胞增殖以及新生血管生成的作用，進(jìn)而修復(fù)重建各類損傷的組織器官。在前期實驗和查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本研究擬通過使用適宜濃度Ang-II預(yù)處理體外培養(yǎng)的hUCMSCs，再將預(yù)處理后的hUCMS

4、Cs（Ang-II-MSCs）移植于全層皮膚缺損動物模型，觀察其對創(chuàng)面修復(fù)重建的效果，以及深入研究Ang-II-MSCs促創(chuàng)面愈合的機制。從而為干細(xì)胞用于臨床治療多種創(chuàng)面提供的研究基礎(chǔ)。
　　方法：
　　(1) Ang-II對hUCMSCs生物學(xué)特性的影響：將培養(yǎng)的hUCMSCs隨機分為4組：0ng/mL Ang-II組（A組）、100ng/mL Ang-II組（B組）、500ng/mL Ang-II組（C組）和1000ng

5、/mL Ang-II組（D組）。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長融合的情況；CCK8法檢測細(xì)胞的增殖情況；AO-EB染色法檢測細(xì)胞的凋亡情況；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的增殖周期和細(xì)胞的凋亡率。ELISA檢測上清液中VEGF、bFGF和HGF的含量。
　　(2) Ang-II預(yù)處理的hUCMSCs（Ang-II-MSCs）促進(jìn)創(chuàng)面愈合的初步探索：實驗分為3組：將18-20kg雄性巴馬小型豬背部切取三個5cm×5cm大小的正方形的創(chuàng)面，制

6、備全層皮膚組織缺損模型。選取創(chuàng)面的9個點，通過局部注射的方式分別含有Ang-II-MSCs（1×107/1 mL ECM）、MSCs（1×107/1 mL ECM）Control（1mL ECM）的1ml培養(yǎng)基注入相應(yīng)全層皮膚缺損模型創(chuàng)面。Image Pro Plus軟件評估各組創(chuàng)面的愈合率，記錄創(chuàng)面的愈合時間。組織化學(xué)染色檢測各組創(chuàng)面組織的整體結(jié)構(gòu)、新生微血管的數(shù)量、膠原的排列情況以及角質(zhì)蛋白K19（CK19）的表達(dá)情況。
　　

7、(3) Ang-II預(yù)處理后 hUCMSCs的上清液（Ang-II-CM）對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖、凋亡及血管形成的影響機制研究：首先將培養(yǎng)的 HUVEC分為3組：培養(yǎng)基組（CM）、MSCs條件培養(yǎng)基組（MSCs-CM）、100ng/mL Ang-II預(yù)處理后MSCs條件培養(yǎng)基組（Ang-II-CM），研究Ang-II-CM對HUVEC的增殖、凋亡的影響。選用1000ng/mL Ang-II致HUVEC損傷，制備凋亡模型。倒

8、置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)；CCK8法檢測各組細(xì)胞的增殖情況；AO-EB、Hoechst染色法、流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況；Western Blot檢測各組細(xì)胞Caspase-3、bcl-2的表達(dá)情況，體外血管生成實驗檢測各組細(xì)胞血管形成能力。在 Ang-II-CM對 HUVEC的增殖、凋亡影響研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，深入探討hUCMSCs旁分泌的VEGF對HUVEC的保護(hù)機制，本實驗繼續(xù)分為以下6組：siRNA-Control+C

9、M、siRNA-Control+MSCs-CM、siRNA-Control+Ang-II-CM、siVEGFR2+CM、siVEGFR2+MSCs-CM、siVEGFR2+Ang-II-CM。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率；Western Blot檢測Caspase-3、bcl-2的表達(dá)情況；體外血管生成實驗檢測細(xì)胞的血管形成情況。
　　結(jié)果：
　?。?） Ang-II對hUCMSCs生物學(xué)特性的影響：與0 ng/mL組相比，5

10、00 ng/mL組和1000 ng/mL組中hUCMSCs的形態(tài)結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，凋亡細(xì)胞的數(shù)目較多，增殖活性較低，上清中細(xì)胞因子水平也均較低，且1000 ng/mL組最為顯著。而100ng/mL組hUCMSCs形態(tài)和結(jié)構(gòu)均正常，未見凋亡細(xì)胞或死亡細(xì)胞，且100ng/mL組細(xì)胞的增殖活性和分泌的細(xì)胞因子均顯著高于0 ng/mL組、500 ng/mL組和1000 ng/mL組。因此，我們篩選100ng/mL Ang-II進(jìn)行預(yù)處理hUCMS

11、Cs。
　?。?） Ang-II預(yù)處理的hUCMSCs（Ang-II-MSCs）促進(jìn)創(chuàng)面愈合的初步探索：在Control組、MSCs組和Ang-II-MSCs組中，Control組創(chuàng)面的愈合效果最差， Ang-II-MSCs組最好。三組創(chuàng)面的愈合時間分別為：55±3d、47±3d和40±3d， Ang-II-MSCs組創(chuàng)面的愈合時間最短。在35d時，三組創(chuàng)面的愈合率分別為(63±4)％、(75±4)%和(88±5)%，Ang-II

12、-MSCs組創(chuàng)面的愈合率最高，且該組創(chuàng)面組織的結(jié)構(gòu)較完整，新生微血管數(shù)量較多、膠原排列更規(guī)整以及上皮化的程度更佳。
　?。?） Ang-II預(yù)處理后的 hUCMSCs上清液（Ang-II-CM）對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖、凋亡、新生血管影響的機制研究： Ang-II-CM對HUVEC增殖、凋亡、新生血管影響的研究結(jié)果表明，與 CM組相比， Ang-II-CM組與 MSCs-CM組中 HUVEC的形態(tài)和結(jié)構(gòu)均較好，其中An

13、g-II-CM組凋亡細(xì)胞或死亡細(xì)胞最少，血管形成數(shù)量和細(xì)胞的增殖活性最好，MSCs-CM組次之。兩組抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平均較CM組高，促凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)水平也較CM組低，而Ang-II-CM組則更為顯著。進(jìn)一步使用siRNA干擾HUVEC中VEGFR2后，結(jié)果顯示：與siRNA-Control組相比，siVEGFR2組中Bcl-2表達(dá)量降低，Caspase-3表達(dá)量增高。此外，siVEGFR2組中凋亡細(xì)胞數(shù)量也

14、較siRNA-Control組顯著增加，而新生微血管的數(shù)量則顯著減少。因此，VEGF和 VEGFR2以及下游調(diào)控的Caspase-3和Bcl-2信號是hUCMSCs發(fā)揮促內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及促內(nèi)皮新生微血管的潛在機制。
　　結(jié)論：
　　綜上所述，適宜濃度（100ng/mL）Ang-II預(yù)處理的 hUCMSCs可促進(jìn)其的增殖、減少凋亡，通過旁分泌高水平的VEGF，與內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR2結(jié)合，抑制下游的促凋亡蛋白