幾種中藥有效成分對脂肪細胞胰島素增敏作用的研究.pdf

1、目的：
　　 1.研究益氣散聚方中藥有效成分黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮等對胰島素抵抗的脂肪細胞模型糖脂代謝的影響,以了解這些有效成分有無改善胰島素抵抗的作用。
　　 2.研究黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮等中藥有效成分對前脂肪分化的作用以及對分化過程中的相關基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor,PPARγ)和CAAT/增強子結合蛋白α(CA

2、AT/Enhancer Binding Protein,C/EBPα)mRNA表達的影響。并與TZD藥物的作用機制進行比較。
　　 3.在研究中藥有效成分對胰島素增敏作用的基礎上,進一步觀察其對胰島素抵抗模型細胞胰島素信號轉導通路的作用及相關細胞因子分泌的影響,探討它們影響胰島素敏感性的可能作用機制。
　　 4.以藥測證,探討胰島素抵抗的中醫(yī)病機特點及治療原則。
　　 方法：
　　 1.幾種中藥有效成分對

3、胰島素抵抗脂肪細胞糖脂代謝的影響
　　 胰島素抵抗脂肪細胞模型的建立與鑒定:將24孔培養(yǎng)板中分化成熟的脂肪細胞以含1％BSA的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后分為正常葡萄糖正常胰島素組及高糖高胰島素組,每組7個樣本。干預培養(yǎng)24h后,通過3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗測定兩組脂肪細胞對葡萄糖的攝取情況。
　　 葡萄糖消耗試驗檢測中藥有效成分對正常3T3-L1脂肪細胞葡萄糖的消耗及細胞活性的影響:實驗設對照組、各中藥有效成分組(

4、黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮)及羅格列酮組。每種中藥有效成分和羅格列酮分別采用五個濃度。干預培養(yǎng)24h,以葡萄糖氧化酶法檢測每孔培養(yǎng)液中葡萄糖的含量,與未接種細胞的空白孔的糖含量均值相減,計算葡萄糖的消耗。葡萄糖消耗實驗結束后移出培養(yǎng)液,二甲氧唑黃比色法(XTT)檢測細胞活力。并結合葡萄糖消耗及XTT檢測結果確定藥物的最適濃度。
　　 3H-脫氧葡萄糖攝取試驗檢測中藥有效成分對胰島素抵抗模型脂肪細胞對葡萄糖攝取能力的影響:實驗設

5、對照組、模型組、中藥有效成分組(黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮)及羅格列酮組,干預培養(yǎng)24h后,在基礎狀態(tài)及胰島素刺激狀態(tài)下通過3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗測定各中藥有效成分對脂肪細胞葡萄糖攝取的影響。
　　 比色法檢測中藥有效成分對胰島素抵抗模型脂肪細胞游離脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)溢出的影響:實驗設對照組、模型組、中藥有效成分組(黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮)及羅格列酮組,干預培養(yǎng)24h后,收集細胞上清液,

6、通過比色法檢測各組FFA溢出情況。
　　 2.幾種中藥有效成分對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響
　　 中藥有效成分對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響:實驗設對照組、中藥有效成分組(黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮)及羅格列酮組,在誘導分化的同時加藥,藥物與分化液同步更換。分化第8天進行油紅O染色,拍攝照片。異丙醇處理染色細胞,570nm波長檢測OD570值。
　　 不同中藥有效成分對3T3-L1前脂肪細胞分化相關基

7、因表達的影響:實驗設對照組、中藥有效成分組(黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮)及羅格列酮組,在誘導分化的同時加藥,藥物與培養(yǎng)液同步更換。分化第8天抽提細胞總RNA,通過實時定量逆轉錄多聚酶聯(lián)反應(Realtime-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)分析脂肪細胞分化相關基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和CAAT/增強子結合蛋白α(C/EBPα)的mRNA表達。
　　 3.幾種中藥有效成分對

8、胰島素抵抗脂肪細胞胰島素信號轉導通路及脂肪細胞因子溢出的影響
　　 3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗檢測PI-3K信號轉導通路阻滯劑Wortmannnin干預下中藥有效成分對胰島素抵抗模型脂肪細胞葡萄糖攝取的影響:實驗設對照組、模型組、中藥有效成分組(黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮)及羅格列酮組,Wortmannin干預30min后,各藥物干預培養(yǎng)24h,通過3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗測定各組脂肪細胞對葡萄糖的攝取情況。
　　

9、Western blot方法檢測中藥有效成分對胰島素信號轉導通路的關鍵蛋白磷酸化表達的影響:實驗設對照組、模型組、中藥有效成分組(黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮)及羅格列酮組,干預培養(yǎng)24h后,收集細胞,提取全細胞蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,通過Western blot方法檢測各組酪氨酸磷酸化胰島素受體β、絲氨酸磷酸化Akt及酪氨酸磷酸化c-Cbl的蛋白表達量。
　　 4.ELISA法檢測中藥有效成分對Resistin,T

10、NFα等脂肪因子分泌的影響
　　 實驗設對照組、模型組、中藥有效成分組(黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮)及羅格列酮組,干預培養(yǎng)24h后,收集細胞上清液。ELISA法測定各組脂肪細胞Resistin及INFα蛋白分泌的情況。
　　 結果：
　　 1.幾種中藥有效成分對胰島素抵抗脂肪細胞糖代謝的影響
　　 胰島素抵抗脂肪細胞模型的建立與鑒定:以正常葡萄糖正常胰島素組作為葡萄糖攝取的正?；?高糖高胰島素組可以使

11、葡萄糖的攝取率下降59.5％。
　　 葡萄糖消耗試驗及XTT試驗檢測中藥有效成分對正常3T3-L1脂肪細胞葡萄糖的消耗及細胞活力的影響:各中藥有效成分在適當的濃度均可顯著增加正常3T3-L1脂肪細胞葡萄糖的消耗,黃芪多糖濃度為0.4g/L時細胞葡萄糖消耗量最大,比對照組增加11％(P＜0.01);小檗堿濃度為40μmol/L,時細胞葡萄糖消耗量達到最大,比對照組增加20％(P＜0.01);蒲黃總黃酮濃度為0.2g/L時葡萄糖消耗

12、量最大,比對照組增加27％(P＜0.01)。XTT檢測結果顯示,黃芪多糖濃度從0.05g/L到0.4g/L對細胞活力無明顯影響;小檗堿濃度超過10μmol/L時,XTT值顯著降低,濃度在5μmol/L以下時對細胞活力影響不大。蒲黃總黃酮濃度從0.05g/L到0.4g/L時,對脂肪細胞活力無明顯影響。結合葡萄糖消耗實驗及XTT檢測結果,每種藥物選取一種最適濃度,分別為:黃芪多糖0.4g/L、小檗堿5μmol/L、蒲黃總黃酮0.2g/L、羅

13、格列酮5μmol/L,在最適濃度下各中藥有效成分均可促進正常3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗(與對照組比較P＜0.01);且對細胞活力無明顯影響。
　　 3H-脫氧葡萄糖攝取試驗檢測中藥有效成分對基礎狀態(tài)下胰島素抵抗脂肪細胞葡萄糖攝取的影響:3T3-L1脂肪細胞經高糖和高胰島素聯(lián)合誘導培養(yǎng)可建立胰島素抵抗的細胞模型。以模型組(MOD)細胞葡萄糖攝取量作為基值(100％),各組葡萄糖攝取量分別與之相比作為各自葡萄糖攝取率。在基礎狀態(tài)

14、下,MOD組攝取率比對照組(CON)減少了46.8％。不同中藥有效成分干預培養(yǎng)24h后,黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮在無胰島素刺激的基礎狀態(tài)下均可促進模型細胞的葡萄糖攝取。其中,APS組的葡萄糖攝取率最高,為MOD的309.8％(P＜0.01),BER組和PTF組分別為MOD組的207.6％(P＜0.05)和298.3％(P＜0.01)。ROS組為MOD組的385.0％(P＜0.01)
　　 3H-脫氧葡萄糖攝取試驗檢測幾種中藥

15、有效成分在胰島素刺激狀態(tài)下對胰島素抵抗脂肪細胞葡萄糖的攝取影響:以MOD組葡萄糖攝取量作為基值(100％),各組葡萄糖攝取量分別與之相比作為各自葡萄糖攝取率。在胰島素刺激下,MOD組葡萄糖攝取比CON減少了59.5％。不同中藥有效成分干預培養(yǎng)24h后,黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮在胰島素刺激狀態(tài)下均可促進模型細胞的葡萄糖攝取。其中,小檗堿組的葡萄糖攝取率最大,為MOD的144.8％(P＜0.01),黃芪多糖和蒲黃總黃酮組分別為MOD組的

16、126.8％(P＜0.01)和121.7％(P＜0.01)。羅格列酮組為MOD的194.9％(P＜0.01)中藥有效成分對3T3-L1脂肪細胞FFA溢出的影響經高糖高胰島素培養(yǎng),MOD組FFA溢出與CON組相比有明顯上升,增加了17.5％。經不同中藥有效成分干預后,細胞上清液的FFA濃度均有不同程度的下降,黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮及羅格列酮組FFA溢出分別比MOD組減少了8.7％、7.1％、16.4％及9.7％(P＜0.01或P＜0

17、.05)。
　　 2.幾種中藥有效成分對3T3-L1前脂肪細胞分化及相關基因表達的影響
　　 中藥有效成分對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響:黃芪多糖、蒲黃總黃酮及羅格列酮均明顯促進細胞的分化(與對照組比較,P＜0.01);小檗堿明顯抑制脂肪細胞的分化(與對照組比較,P＜0.01)。各中藥有效成分組分化程度均低于羅格列酮組(與羅格列同組比較,P＜0.01)。
　　 中藥有效成分對3T3-L1前脂肪細胞分化相關基因

18、表達的影響:黃芪多糖及蒲黃總黃酮明顯促進脂肪細胞PPARγmRNA的表達(P＜0.01);而小檗堿組PPARγmRNA的表達量顯著低于對照組(P＜0.01)。黃芪多糖組及蒲黃總黃酮組C/EBPαmRNA表達量比對照組明顯上調(P＜0.01);而小檗堿顯著抑制C/EBPαmRNA的表達(與對照組比較,均P＜0.01)。各中藥有效成分組PPARγ及C/EBPα的mRNA表達量均低于羅格列酮組(P＜0.01)。
　　 3.幾種中藥有效

19、成分對胰島素抵抗脂肪細胞胰島素信號轉導通路及脂肪細胞因子溢出的影響
　　 3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗檢測PI-3K信號轉導通路阻滯劑Wortmannnin干預下中藥有效成分對胰島素抵抗模型脂肪細胞葡萄糖攝取的影響:
　　 加入Wortmannin干預后,MOD組葡萄糖攝取率比同樣接受Wortmannin作用的CON組下降了47.8％,黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮及羅格列酮干預模型細胞后,葡萄糖攝取比MOD組分別增加了86

20、.8％、190.8％、187.4％和201.1％。在各實驗組加與不加Wortmannin的自身比較中,CON、MOD、黃芪多糖和羅格列酮組加Wortmannin后的葡萄糖攝取率比不加Wortmannin時均有降低,分別為不加Wortmannin時的60.3％、45.6％、78.3％和76.9％。而小檗堿及蒲黃總黃酮組Wortmannin干預前后的葡萄糖攝取率并未有統(tǒng)計學差異。
　　 Western blot方法檢測中藥有效成分對

21、胰島素信號轉導通路關鍵蛋白的磷酸化表達的影響:以MOD組InsRβ蛋白酪氨酸磷酸化表達量作為基值,各組與之相比計算InsRβ磷酸化表達的相對定量。胰島素抵抗模型細胞比較與正常細胞相比InsRβ磷酸化表達有顯著下調(P＜0.01);與MOD組比較,各中藥有效成分及羅格列酮組均使胰島素抵抗脂肪細胞模型InsRβ酪氨酸磷酸化表達顯著上調(P＜0.01)。
　　 以MOD組絲氨酸磷酸化Akt蛋白表達量作為基值,各組與之相比計算磷酸化Ak

22、t蛋白表達的相對定量。MOD組絲氨酸磷酸化Akt蛋白表達明顯下調(P＜0.01);各中藥有效成分及ROS組均可不同程度的上調模型細胞Akt蛋白絲氨酸磷酸化水平,各組與MOD組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 以MOD組酪氨酸磷酸化c-Cbl蛋白表達量作為基值,各組與之相比計算磷酸化c-Cbl蛋白表達的相對定量。MOD組酪氨酸磷酸化c-Cbl蛋白表達顯著下調(P＜0.01)。各中藥有效成分及ROS組均可不同程度的上調模型

23、細胞c-Cbl蛋白酪氨酸磷酸化水平,與MOD組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 ELISA法檢測中藥有效成分對TNFα、Resistin等脂肪細胞因子分泌的影響:與CON組相比,MOD組TNFα的分泌有明顯上升,增加了57.6％。黃芪多糖及羅格列酮干預后,細胞培養(yǎng)液中的TNFα濃度有不同程度的下降,分別比MOD組減少19.9％(P＜0.05)和17.4％(P＜0.01)。而小檗堿及蒲黃總黃酮組與MOD組相比TNFα的水

24、平未見統(tǒng)計學差異。
　　 MOD組脂肪細胞分泌Resistin的濃度與CON組相比無統(tǒng)計學差異。黃芪多糖、蒲黃總黃酮及羅格列酮干預后,細胞培養(yǎng)液中的Resistin濃度有不同程度的下降,分別比MOD組減少了27.9％(P＜0.01)、13.7％(P＜0.05)和30.9(P＜0.01)。而小檗堿組與MOD組相比Resistin的水平未見統(tǒng)計學差異。
　　 結論：
　　 1、成熟脂肪細胞經高糖高胰島素培養(yǎng)24h能明

25、顯抑制其葡萄糖的攝取,可誘導建立胰島素抵抗細胞模型。適用于有關藥物篩選及機制研究。
　　 2、黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮等中藥有效成分可在對培養(yǎng)細胞基本無毒的安全濃度范圍內,在基礎及胰島素刺激狀態(tài)下不同程度增加脂肪細胞對胰島素的敏感性,改善胰島素抵抗模型脂肪細胞的糖脂代謝。
　　 3、黃芪多糖及蒲黃總黃酮促進3T3-L1前脂肪細胞的分化,上調分化相關基因PPARγ mRNA的表達,表現出類似PPARγ激動劑的效應;小檗

26、堿抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化,減少細胞內脂質的積聚,下調脂肪細胞分化相關基因PPARγ mRNA和C/EBPα mRNA的表達,表現出類似PPARγ抑制劑的效應。中藥復方中不同成分的作用取向,體現了中藥作用的多靶點多途徑的特點,為胰島素抵抗的防治提供新的思路,可以拓寬應用中醫(yī)藥或中西醫(yī)結合方法防治胰島素抵抗的途徑。
　　 4、APS、BER、PTF可通過對胰島素信號轉導通路的影響而改善胰島素抵抗。三種有效成分均可促進胰島素

27、刺激下胰島素受體β亞基酪氨酸磷酸化水平,從而活化受體后的信號轉導通路。APS改善胰島素抵抗至少有部分是通過PI-3K途徑起作用的。而BER和PTF更有可能是通過干預c-Cbl/CAP途徑而改善胰島素抵抗。
　　 5、中藥有效成分可以明顯降低胰島素抵抗狀態(tài)下脂肪細胞TNFαQ、Resistin等胰島素抵抗正相關細胞因子的分泌。
　　 6、對益氣散聚方中藥的主要有效成分的細胞學研究證明這些有效成分有改善胰島素抵抗的作用,且作