粉筆塵化學(xué)成分分析及對(duì)肺組織損傷的分子機(jī)制研究.pdf

1、粉筆作為一種重要的教學(xué)工具，在一些國家和地區(qū)的使用仍然非常普遍。粉筆教學(xué)可產(chǎn)生空氣動(dòng)力學(xué)直徑<10μm的顆粒（PM10）和<2.5μm的顆粒（PM2.5）。這些細(xì)小的顆粒物可隨著人體呼吸吸入下呼吸道，特別是PM2.5易于沉積在細(xì)支氣管和肺泡區(qū)域，并可能進(jìn)入血液循環(huán)。因此，粉筆的使用可能影響教師和學(xué)生的健康。研究表明，教室粉筆塵短期暴露會(huì)影響教師肺氣道功能；長期暴露則可能誘發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致塵肺。然而，有關(guān)可吸入粉筆塵在環(huán)境毒理

2、學(xué)方面的研究還未見報(bào)道。由于粉筆塵的毒性與其物理化學(xué)性質(zhì)有很大關(guān)系，本論文擬開展研究粉筆在寫擦過程中產(chǎn)生的顆粒物形貌及化學(xué)組成；同時(shí)利用大鼠肺泡巨噬細(xì)胞（AMs）作為體外染毒模型，采用氣管滴注法建立大鼠體內(nèi)染毒模型，研究粉筆塵可吸入顆粒物對(duì)大鼠肺組織損傷的分子機(jī)制，為人們科學(xué)認(rèn)識(shí)粉筆塵顆粒物危害提供一定的理論依據(jù)。
　　本文利用電子探針X-射線微區(qū)分析技術(shù)（ED-EPMA）分析了來自于三種不同廠家白色無塵粉筆的粉筆塵形貌及化學(xué)組成

3、。結(jié)果表明，三種粉筆在寫擦過程中既產(chǎn)生>10μm的顆粒，也能產(chǎn)生PM10、PM2.5和PM1。這些顆粒物形狀呈球形，長方體，正方體或不規(guī)則形狀；X射線能譜發(fā)現(xiàn)粉筆塵PM2.5的主要元素成分為S、O和Ca，還含有少量C、Mg和Si等。運(yùn)用Monte Carlo程序計(jì)算粉筆塵PM2.5中元素的原子濃度，并根據(jù)化學(xué)計(jì)量學(xué)推測(cè)其分子構(gòu)成，結(jié)果表明粉筆塵主要由CaSO4、CaCO3/CaMg(CO3)2、CaSiO3、SiO2和少量有機(jī)粘結(jié)劑組成

4、。
　　本研究同時(shí)以大鼠肺泡巨噬細(xì)胞（AMs）為體外模型，采用化學(xué)發(fā)光法研究粉筆塵可吸入顆粒物誘導(dǎo)AMs產(chǎn)生活性氧和活性氮（ROS/RNS）的機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）粉筆塵PM2.5或PM10可劑量依賴性增加AMs的化學(xué)發(fā)光；而0.5μmol/L二苯基氯化碘鹽（DPI）和1mmol/L的左旋-N-硝基精氨酸甲酯（L-NAME）均可顯著抑制粉筆塵顆粒誘導(dǎo)AMs的化學(xué)發(fā)光，表明粉筆塵PM2.5或PM10可引起AMs呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生ROS/

5、RNS。（2）CaSO4/CaCO3 PM2.5或PM10濃度依賴地誘導(dǎo)AMs產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，且CaSO4/CaCO3相同組分的顆粒粒徑越小，誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光能力越強(qiáng)。CaCO3顆粒誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光的能力強(qiáng)于同粒徑CaSO4。（3）抗霉素A，超氧化物歧化酶（SOD），DPI和L-NAME均可顯著抑制CaSO4和CaCO3顆粒誘導(dǎo)AMs的化學(xué)發(fā)光，提示粉筆塵誘導(dǎo)AMs生成的ROS可能源于細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶和線粒體復(fù)合物Ⅲ，RNS則源于細(xì)胞內(nèi)一氧

6、化氮合酶（NOS）激活。結(jié)合粉筆塵化學(xué)組成分析，CaSO4和CaCO3可能是粉筆塵誘導(dǎo)AMs產(chǎn)生ROS/RNS的主要因素。
　　為了解粉筆塵顆粒誘導(dǎo)生成的 ROS/RNS是否對(duì) AMs造成進(jìn)一步的損傷，本文同時(shí)測(cè)定了AMs中氧化應(yīng)激的指標(biāo)（SOD、GSH、CAT和MDA）、細(xì)胞質(zhì)膜酶（Na+K+-ATP和Ca2+Mg2+-ATP）、酸性磷酸酶（ACP）、胞外NO和乳酸脫氫酶（LDH）的含量，并測(cè)定了AMs炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平及其

7、細(xì)胞活性。結(jié)果表明：（1）25μg/mL粉筆塵PM2.5可顯著降低AMs中SOD的活性。而100μg/mL粉筆塵PM2.5既顯著降低AMs中SOD的含量，也顯著增加細(xì)胞中MDA的含量。300μg/mL粉筆塵也可降低SOD活性，并可顯著增加 AMs中CAT活性和MDA含量。而粉筆塵PM10僅在300μg/mL時(shí)顯著增加CAT活性與MDA含量，降低SOD和GSH活性。其中，所有劑量的粉筆塵PM2.5降低SOD活性的能力明顯強(qiáng)于PM10。30

8、0μg/mL粉筆塵PM2.5增加MDA含量的能力也明顯強(qiáng)于PM10。（2）劑量為25、100和300μg/mL粉筆塵PM2.5顯著升高Ca2+Mg2+-ATP活性。而在300μg/mL劑量下，粉筆塵 PM10可顯著降低Na+K+-ATP、Ca2+Mg2+-ATP和ACP的活性。PM2.5與PM10相比，兩者對(duì)Na+K+-ATP、Ca2+Mg2+-ATP和ACP的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（3）100和300μg/mL的粉筆PM2.5或PM10均

9、可顯著增強(qiáng)AMs釋放NO的能力，且PM2.5釋放NO的能力小于PM10。（4）在300μg/mL劑量下，粉筆PM10可顯著上調(diào)TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平，且與PM2.5相比兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在25、100、300μg/mL三個(gè)劑量下，粉筆PM2.5均能顯著增加細(xì)胞內(nèi)IL-6 mRNA的表達(dá)，而PM10對(duì)IL-6的表達(dá)無顯著性影響。與對(duì)照組相比，粉筆PM10和PM2.5在300μg/mL下都可上調(diào)TGF-β1mRNA表達(dá)，但兩者相比并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

10、異。這些結(jié)果表明PM10或PM2.5都可誘發(fā)AMs產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，其中，PM2.5的效應(yīng)明顯強(qiáng)于PM10。（5）在300μg/mL劑量下，PM2.5或PM10均可引起AMs細(xì)胞外LDH增加，細(xì)胞活性降低，且PM10對(duì)細(xì)胞活性和LDH的影響較PM2.5小，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？傊?，PM10和PM2.5對(duì)大鼠AMs產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引起脂質(zhì)過氧化，釋放NO及調(diào)節(jié)TNF-α和TGF-β的轉(zhuǎn)錄水平，引起炎癥損傷，但PM2.5誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的能力

11、強(qiáng)于PM10。
　　本文同時(shí)利用 HE染色研究了粉筆塵PM2.5染毒大鼠的肺組織病理學(xué)，應(yīng)用熒光定量RT-PCR法和western blot研究了染毒大鼠肺組織中炎癥因子（TNF-α、IL-6、iNOS和ICAM）及其他纖維化因子（VEGF-A、TF、TGF-β、PDGF-D等）的轉(zhuǎn)錄水平及p38、ERK1/2、JNK-2 MAPK、STAT-3和Smad-3的蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）8和32mg/kg粉筆塵可使大鼠肺組織中IL

12、-6 mRNA表達(dá)增加。32mg/kg染毒組大鼠肺組織中TNF-αmRNA表達(dá)增加。（2）8和32mg/kg粉筆PM2.5均可上調(diào)染毒組大鼠肺組織iNOS mRNA表達(dá)。提示炎性細(xì)胞因子的增加可能導(dǎo)致NO增加。（3）2、8、32mg/kg三個(gè)劑量組均可使ICAM-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，表明粉筆塵PM2.5可促進(jìn)炎性細(xì)胞的遷移和趨化，釋放炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6，加快炎癥反應(yīng)的發(fā)展。（4）HE染色表明與對(duì)照組相比，8和32mg/k

13、g粉筆塵PM2.5可使大鼠肺組織出現(xiàn)輕微的組織損傷，比如局部的充血，炎性細(xì)胞浸潤。（5）與生理鹽水組相比，2、8、32mg/kg三個(gè)劑量組均可劑量依賴性地增加染毒大鼠肺組織內(nèi)VEGF-A、STAT-3和Col Iα1 mRNA的表達(dá)水平。8和32mg/kg劑量組可使TGF-β、PDGF-D、PDGFR-βmRNA的表達(dá)顯著增加。32mg/kg劑量組可使Smad-3 mRNA的表達(dá)顯著增加。三個(gè)劑量組染毒對(duì)大鼠肺組織中TF mRNA的表達(dá)

14、及STAT-3和Smad-3蛋白表達(dá)無顯著影響。（6）在8和32mg/kg劑量下，粉筆塵PM2.5可顯著提高HO-1 mRNA表達(dá)。N-乙酰半胱氨酸（NAC）可顯著降低32mg/kg劑量下粉筆塵PM2.5對(duì)HO-1 mRNA表達(dá)的影響。（7）8和32 mg/kg劑量組可使大鼠肺組織中p38蛋白表達(dá)增加，32mg/kg劑量組可使大鼠肺組織中ERKs蛋白表達(dá)增加。表明高劑量的粉筆塵PM2.5對(duì)肺組織的損傷與p38和ERKs信號(hào)通路有關(guān)，而在

15、8mg/kg劑量下p38信號(hào)通路可能起主要作用。（8）NAC可使肺組織中VEGF-A、PDGF-D/PDGFR-β、Col Iα1的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。表明NAC對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的氧化損傷有一定的保護(hù)作用，從而緩解粉筆PM2.5誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和纖維化反應(yīng)。
　　綜上所述，粉筆塵可吸入顆粒物可誘導(dǎo)AMs產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，釋放ROS/RNS。過量的ROS/RNS消耗細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶，引起脂質(zhì)過氧化，造成氧化損傷。同時(shí)，這些顆粒物可引起ACP酶