鄂西北地區(qū)柴胡與北柴胡品質(zhì)的比較研究.pdf

1、目的：通過(guò)對(duì)鄂西北地區(qū)所產(chǎn)柴胡的資源調(diào)查、品質(zhì)評(píng)價(jià)以及與北柴胡的品質(zhì)比較研究，為藥用柴胡新資源的發(fā)現(xiàn)、開(kāi)發(fā)與利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.鄂西北地區(qū)柴胡的資源調(diào)查和品種鑒定研究
　　 1.1 鄂西北地區(qū)柴胡的資源調(diào)查對(duì)鄂西北地區(qū)野生與栽培柴胡品種進(jìn)行資源調(diào)查研究，采集并制作鄂西北地區(qū)原植物標(biāo)本20余份，比較鑒別其根、莖、葉、花、果實(shí)、種子的異同，建立植物分類檢索表。
　　 1.2

2、鄂西北地區(qū)竹葉柴胡品種鑒別研究建立竹葉柴胡與北柴胡、三島柴胡的藥材及種子性狀、顯微、理化、TLC等特征鑒別方法。通過(guò)石蠟切片法觀察竹葉柴胡、北柴胡和三島柴胡根及種子的顯微結(jié)構(gòu)，并分別制作藥材和種子的橫切片進(jìn)行顯微鑒定;利用泡沫反應(yīng)鑒別不同品種的柴胡;按照薄層色譜法，鑒別竹葉柴胡與北柴胡。
　　 1.3 鄂西北地區(qū)柴胡與北柴胡的遺傳多樣性ISSR分析利用分子標(biāo)記ISSR技術(shù)對(duì)鄂西北地區(qū)柴胡種群進(jìn)行遺傳多樣性分析并建立其遺傳多樣性指

3、紋圖譜，從分子生物學(xué)的角度分析鄂西北地區(qū)竹葉柴胡與其他柴胡的主要差別及其親緣關(guān)系。
　　 1.4 鄂西北地區(qū)竹葉柴胡野生變家種關(guān)鍵技術(shù)研究通過(guò)對(duì)鄂西北地區(qū)柴胡生長(zhǎng)的物候?qū)W觀察，初步制定鄂西北地區(qū)竹葉柴胡種子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);徒手切片法觀察竹葉柴胡種子特征，考察溫度和不同培養(yǎng)介質(zhì)對(duì)種子發(fā)芽率的影響;考察鄂西北地區(qū)竹葉柴胡的最佳采收期。
　　 2.鄂西北地區(qū)竹葉柴胡與北柴胡的質(zhì)量評(píng)價(jià)比較研究
　　 2.1 鄂西北地區(qū)竹葉柴

4、胡與北柴胡的藥用成分的比較分析采用HPLC法測(cè)定柴胡藥材中柴胡皂苷a(SSa)、柴胡皂苷d(SSd)的含量，比較鄂西北地區(qū)竹葉柴胡與北柴胡中柴胡總皂苷(SSt)的差異;采用蒽酮-硫酸比色法，測(cè)定柴胡中可溶性多糖和粗多糖含量，比較兩者總多糖的含量差異;采用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定總黃酮的含量;采用紫外分光光度法測(cè)定柴胡中揮發(fā)油含量，并進(jìn)行醇溶性浸出物、總灰分、酸性不溶性灰分測(cè)定;使用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)量竹葉柴胡經(jīng)蜜制、酒制、醋制前后揮發(fā)油和

5、總皂苷的含量，比較鄂西北地區(qū)竹葉柴胡經(jīng)不同方法炮制前后有效成分的含量;采用HPLC法比較分析不同產(chǎn)地的HPLC圖譜，建立鄂西北地區(qū)竹葉柴胡HPLC指紋圖譜;采用UPLC-MS聯(lián)用技術(shù)，建立柴胡藥材的特征圖譜，鑒定分析柴胡中的主要成分，在此基礎(chǔ)上對(duì)主要成分進(jìn)行定量分析。
　　 2.2 鄂西北地區(qū)竹葉柴胡與北柴胡的藥理活性比較研究鄂西北地區(qū)竹葉柴胡與北柴胡的解熱鎮(zhèn)痛作用的比較:采用2，4-二硝基苯酚致熱大鼠模型比較兩種柴胡水煎液的解

6、熱作用;采用醋酸扭體實(shí)驗(yàn)及熱板法比較兩種柴胡水煎液及醇提液的鎮(zhèn)痛作用。
　　 鄂西北地區(qū)竹葉柴胡與北柴胡的抗炎、保肝作用的比較:采用二甲苯致耳殼腫脹及蛋清致足腫脹的小鼠模型比較兩種柴胡水煎液的抗炎作用;采用四氯化氮的花生油溶液復(fù)制小鼠肝損傷模型，檢測(cè)小鼠的血清生化指標(biāo)ALT、AST、ALP;檢測(cè)肝組織勻漿生化指標(biāo)SOD、MDA、GSH，觀察小鼠肝組織病理切片及免疫組化指標(biāo)，比較鄂西北地區(qū)竹葉柴胡與北柴胡根的抗炎、保肝作用。

7、>　　 結(jié)果：
　　 1.鄂西北地區(qū)竹葉柴胡的資源調(diào)查和品種鑒定研究
　　 1.1 鄂西北地區(qū)竹葉柴胡的資源調(diào)查本地區(qū)所產(chǎn)柴胡習(xí)稱“北柴胡”，經(jīng)鑒定多為傘形科植物竹葉柴胡Bupleurum.marginatum Wall.ex DC.的干燥根，少數(shù)為石竹科植物蠅子草Silene fortunei Vis.的干燥根。
　　 1.2 鄂西北地區(qū)竹葉柴胡的品種鑒別
　　 1.2.1 竹葉柴胡與北柴胡原植物性狀

8、鑒別特征竹葉柴胡:小總苞片窄而小，披針形，葉較厚，近革質(zhì)，有白色軟骨質(zhì)邊緣。根粗厚，紡錘形，表面通常深紅棕色或棕褐色。莖基部扭曲，少有分枝，上部葉長(zhǎng)披針形，綠色，不向下反折。
　　 北柴胡:葉較薄，無(wú)白色軟骨質(zhì)邊緣。根通常有分支或不分枝，表面通常淡黃色。莖單一或叢生，枝條稍呈之字形彎曲。小總苞片較厚，三脈，邊緣不透明;小傘形花序多而小。
　　 1.2.2 竹葉柴胡與北柴胡根的顯微特征竹葉柴胡根(2～3mm)橫切面木栓細(xì)胞

9、3～5列，皮層狹窄。韌皮部較發(fā)達(dá)，薄壁細(xì)胞35～45列。形成層成環(huán)，木質(zhì)部寬廣，約占直徑的2/3，導(dǎo)管切向排列，直徑10～50μm，木纖維束和木薄壁細(xì)胞在木質(zhì)部中部排列成續(xù)斷的環(huán)狀，木質(zhì)部外側(cè)無(wú)木纖維束和木薄壁細(xì)胞。
　　 北柴胡根(2～3mm)橫切面木栓細(xì)胞5～8列。皮層細(xì)胞8～15列，細(xì)胞呈切向延長(zhǎng)，皮層內(nèi)側(cè)油管散在排列，油管由8，～12個(gè)細(xì)胞組成，直徑20～45μm，內(nèi)含淡黃色油狀物。韌皮部寬廣，約占直徑的1/3，內(nèi)含散在

10、油管。形成層成環(huán)。木質(zhì)部寬廣，導(dǎo)管切向排列，多排列成行，直徑10～53μm，木纖維束和木薄壁細(xì)胞較多，排列成1至多個(gè)續(xù)斷的環(huán)狀，射線3～5列。
　　 1.2.3 竹葉柴胡與北柴胡的理化及薄層色譜鑒別各柴胡樣本均產(chǎn)生泡沫，山西省運(yùn)城縣種植的北柴胡和湖北省?？悼h種植的竹葉柴胡產(chǎn)生的泡沫少于野生竹葉柴胡，放置后消失較快，但在鄂西北地區(qū)竹山、竹溪、鄖縣等地作柴胡使用的柴胡偽品石竹科植物蠅子草根可產(chǎn)生非常明顯的泡沫，且保持長(zhǎng)時(shí)間不消失。<

11、br>　　 各藥材樣品與對(duì)照藥材的主要斑點(diǎn)相同，在對(duì)照品SSa、SSd相應(yīng)的位置均顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)。說(shuō)明竹葉柴胡、北柴胡以及三島柴胡的主要成分相近，利用TLC可以鑒別柴胡，但不能有效區(qū)分不同品種的柴胡。
　　 1.3 鄂西北地區(qū)竹葉柴胡和北柴胡的遺傳多樣性ISSR研究7條ISSR引物共擴(kuò)增出115個(gè)ISSR條帶，其中多態(tài)性帶59條，多態(tài)性比率高達(dá)51.4％;12個(gè)竹葉柴胡共擴(kuò)增出81條ISSR條帶，多態(tài)性帶42條，多

12、態(tài)性比率高達(dá)51.9％。12個(gè)竹葉柴胡樣品聚為一類，另兩個(gè)北柴胡樣品聚為另一類，兩者的相似系數(shù)為0.55，說(shuō)明竹葉柴胡與北柴胡有較近的親緣關(guān)系。
　　 1.4 鄂西北地區(qū)竹葉柴胡野生變家種關(guān)鍵技術(shù)研究
　　 1.4.1 竹葉柴胡種子萌發(fā)特性研究不同濃度竹葉柴胡外種皮浸提液處理的柴胡種子萌發(fā)率、萌發(fā)勢(shì)與對(duì)照組比較有差異顯著，且隨濃度升高抑制作用明顯增強(qiáng)，表明種皮中存在抑制種子萌發(fā)抑制物質(zhì);竹葉柴胡種子培養(yǎng)床的選擇以濾紙最優(yōu)

13、，40℃溫水浸種能使竹葉柴胡的發(fā)芽率提高到64.8％;發(fā)芽介質(zhì)對(duì)竹葉柴胡的種子無(wú)顯著性的影響，但是30℃以上的萌發(fā)溫度使種子發(fā)芽率顯著降低。
　　 1.4.2 竹葉柴胡最佳采收期研究竹葉柴胡SSa、SSd的含量從5月至7月呈遞增趨勢(shì)，到7月含量達(dá)最高，然后持續(xù)下降，到10月后地上部分枯萎進(jìn)入休眠期含量達(dá)到最低，說(shuō)明從SSa、SSd分析，本地區(qū)柴胡的采收應(yīng)該在其地上部分枯萎前進(jìn)行。
　　 2.鄂西北地區(qū)竹葉柴胡與北柴胡的質(zhì)

14、量評(píng)價(jià)比較
　　 2.1 鄂西北地區(qū)竹葉柴胡與北柴胡的藥用成分比較研究鄂西北地區(qū)竹葉柴胡野生品、種植品的SSt含量相近，低于河南、甘肅的野生柴胡，但明顯高于山西省萬(wàn)榮縣的北柴胡和湖北省南漳縣的三島柴胡，結(jié)果表明鄂西北地區(qū)竹葉柴胡質(zhì)量較好。
　　 河南省內(nèi)鄉(xiāng)縣和湖北省秭歸縣的竹葉柴胡總皂苷含量較高，湖北省房縣野人谷鎮(zhèn)野生竹葉柴胡、?？悼h栽培品竹葉柴胡和山西省運(yùn)城縣的北柴胡總皂苷含量相近，說(shuō)明生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)柴胡有效成分含量有明顯

15、影響。
　　 鄂西北地區(qū)種植的竹葉柴胡與野生竹葉柴胡相比，多糖含量稍低，竹葉柴胡地上部分也含有一定量的多糖成分，湖北省南漳縣種植的三島柴胡和山西省運(yùn)城縣種植的北柴胡中的多糖含量較高，結(jié)果顯示不同品種、不同生長(zhǎng)條件和部位柴胡中多糖含量有較大差異。
　　 鄂西北地區(qū)竹葉柴胡野生品根中黃酮含量高于種植品，鄂西北地區(qū)竹葉柴胡地上部分總黃酮含量明顯高于地下部分;湖北省房縣野人谷鎮(zhèn)野生柴胡根的黃酮含量高于山西省運(yùn)城縣、甘肅及湖北省南

16、漳縣的種植品;結(jié)果顯示地上部分總黃酮含量明顯高于柴胡根，說(shuō)明柴胡的使用應(yīng)根據(jù)其所發(fā)揮的藥理作用選用合適的藥用部位。
　　 竹葉柴胡中揮發(fā)油含量高于北柴胡和三島柴胡;鄂西北地區(qū)種植的柴胡揮發(fā)油含量高于野生柴胡揮發(fā)油含量，說(shuō)明柴胡藥材適于實(shí)施野生變家種。
　　 炮制后，揮發(fā)油的含量明顯高于生柴胡，揮發(fā)油的含量高低依次為蜜柴胡＞酒柴胡＞醋柴胡＞生柴胡;柴胡總皂苷含量高低依次為蜜柴胡＞生柴胡＞醋柴胡＞酒柴胡，即柴胡蜜制品皂苷含量

17、高于生品，但酒制品和醋制品中總皂苷含量低于生品，運(yùn)用SPSS16.0進(jìn)行單因素方差分析表明，生柴胡與醋制品、酒制品總皂苷含量有顯著性差異(P＜0.05)，其它各組之間均有極顯著差異(P＜0.01)，說(shuō)明柴胡炮制前后性味功效的變化是由于化學(xué)成分發(fā)生了轉(zhuǎn)化，由此引起其藥理作用的轉(zhuǎn)變符合中藥炮制理論。
　　 不同柴胡品種的化學(xué)成分指紋圖譜共檢出8個(gè)分離度良好的共有峰。北柴胡、小柴胡指紋圖譜相似度相差較小，竹葉柴胡地上部分、三島柴胡指紋

18、圖譜相似度相差很大。
　　 根據(jù)質(zhì)譜信息共分離鑒定了7個(gè)皂苷類化合物并作為柴胡藥材的特征圖譜峰，各個(gè)柴胡樣本其特征峰的相對(duì)峰面積有顯著差異，柴胡皂苷C、A、D的含量也有明顯差別。
　　 2.2 鄂西北地區(qū)竹葉柴胡與北柴胡的藥理活性比較研究竹葉柴胡和北柴胡的水煎液均具有明顯的解熱作用，兩者解熱作用沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05);醋酸扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明竹葉柴胡和北柴胡水煎液、醇提液均有鎮(zhèn)痛作用，且兩者沒(méi)有顯著性差異;熱板法實(shí)驗(yàn)

19、結(jié)果表明兩種柴胡水煎液有鎮(zhèn)痛作用且無(wú)明顯差異(P＞0.05)，但醇提液無(wú)明顯鎮(zhèn)痛作用。
　　 耳腫脹度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明竹葉柴胡和北柴胡水煎液均具有明顯抗炎作用，兩者抗炎作用沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05);足腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明竹葉柴胡高劑量組和北柴胡高低劑量組在2h、4h、6h時(shí)均有抗炎作用，且與北柴胡抗炎作用比較沒(méi)有顯著性差異;竹葉柴胡低劑量組、北柴胡高低劑量組ALT、AST與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);各治療組ALP與模

20、型組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);竹葉柴胡高低劑量組和北柴胡高低劑量組SOD與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;竹葉柴胡10.0g/kg和北柴胡10.0g/kg劑量組的MDA、GSH與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。病理切片及免疫組化結(jié)果顯示，竹葉柴胡和北柴胡均有保肝作用，且兩者沒(méi)有顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.鄂西北地區(qū)所產(chǎn)柴胡習(xí)稱為“北柴胡”品種實(shí)際為竹葉柴胡的干燥根，是鄂西北地區(qū)的主流柴胡品種。
　　 2.鄂西北

21、地區(qū)竹葉柴胡生物多樣性和種質(zhì)資源較為豐富，有利于竹葉柴胡資源開(kāi)發(fā)利用;ISSR分子標(biāo)記特征能顯著區(qū)別竹葉柴胡與其近緣種北柴胡等，可作為分子特征進(jìn)行物種鑒別。
　　 3.竹葉柴胡種子中含有發(fā)芽抑制物質(zhì)和胚后熟是影響其種子發(fā)芽率的重要原因。
　　 4.建立了鄂西北地區(qū)竹葉柴胡的指紋圖譜和質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，可以作為竹葉柴胡藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的依據(jù)，從而保證其臨床用藥安全、質(zhì)量可控。
　　 5.測(cè)定了不同產(chǎn)地野生和種植竹葉柴胡根的

22、有效成分，通過(guò)與其它柴胡品種和中國(guó)藥典收錄的北柴胡標(biāo)準(zhǔn)藥材相比較，發(fā)現(xiàn)其有效成分含量相當(dāng)于北柴胡樣品，高于藥典的所規(guī)定的柴胡含量標(biāo)準(zhǔn);其降熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝活性作用也接近或超過(guò)北柴胡樣品;ISSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)竹葉柴胡與北柴胡是親緣關(guān)系緊密聯(lián)系的兩個(gè)種。綜上所述，竹葉柴胡是優(yōu)質(zhì)柴胡的藥用植物資源之一，與北柴胡有較近的親緣關(guān)系和相似的藥用品質(zhì)?；谥袢~柴胡長(zhǎng)期作為柴胡藥材應(yīng)用的歷史，且是我國(guó)三大柴胡主流商品之一，而鄂西地區(qū)竹葉柴胡一直