L-periaxin與Ezrin相互作用模式分析.pdf

1、軸周蛋白(Periaxin)是外周神經(jīng)系統(tǒng)非致密性髓鞘中特異表達(dá)的一種蛋白，其占外周神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘蛋白的16％，對(duì)髓鞘形成的初始化有重要作用。但隨著髓鞘的成熟，Periaxin在細(xì)胞中的定位逐漸變化，表達(dá)量也逐漸降低。L-periaxin是periaxin編碼的一種蛋白亞型，其含PDZ(PSD-95/Dlg-/Zo-1 domain)，核定位信號(hào)(Nuclear localization signal，NLS)，重復(fù)區(qū)域(Repeat d

2、omain)和酸性區(qū)域(Acidic domain)四個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中PDZ結(jié)構(gòu)域是可以識(shí)別并結(jié)合受體靶蛋白羧基末端的結(jié)構(gòu)域。埃茲蛋白(Ezrin)是普遍存在的細(xì)胞-膜骨架蛋白，它可在多種細(xì)胞類型中表達(dá)。在有髓施萬(wàn)細(xì)胞的質(zhì)膜上，包括Ezrin在內(nèi)的ERM(Ezrin-Radixin-Moesin)蛋白家族的三個(gè)蛋白都可高水平表達(dá)。Ezrin蛋白包括FERM結(jié)構(gòu)域，α螺旋結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域三部分。Ezrin自身的氨基端與羧基端可以相互作用

3、，形成自我抑制的構(gòu)象，而567位蘇氨酸(Thr,T)的磷酸化卻可以解除該抑制。L-periaxin與Ezrin除了能共同表達(dá)在施萬(wàn)細(xì)胞中外，二者在小鼠晶狀體六角形纖維細(xì)胞中共同參與晶狀體的成熟與裝配。
　　本文圍繞L-periaxin與Ezrin蛋白之間的相互作用開展其互作模式的分析。首先通過免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了施萬(wàn)細(xì)胞 RSC96株系中內(nèi)源Periaxin與Ezrin的共定位情況，結(jié)果顯示二者在細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中有明顯的共定

4、位現(xiàn)象。為了明確二者相互作用的具體區(qū)域，采用基因克隆技術(shù)，構(gòu)建含Myc標(biāo)簽的L-periaxin蛋白的不同結(jié)構(gòu)域以及含F(xiàn)lag標(biāo)簽的Ezrin蛋白的不同結(jié)構(gòu)域的重組質(zhì)粒。將不同截短型的蛋白分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入施萬(wàn)細(xì)胞RSC96，免疫熒光法觀察兩蛋白不同結(jié)構(gòu)域間的定位情況，結(jié)果揭示L-periaxin的N端區(qū)域(1-200aa)與C端區(qū)域(1060-1461aa)可以與內(nèi)源Ezrin發(fā)生共定位， Ezrin的N端區(qū)域(1-296aa)與C端區(qū)

5、域(475-585aa)可以與內(nèi)源L-periaxin發(fā)生共定位；結(jié)合免疫共沉淀確定L-periaxin與Ezrin的相互作用方式為“頭對(duì)頭，尾對(duì)尾”。進(jìn)一步又通過雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)合免疫共沉淀將L-periaxin與Ezrin的作用區(qū)域確定為L(zhǎng)-periaxin的NLS結(jié)構(gòu)域(104-200aa)和Ezrin的FERM結(jié)構(gòu)域(1-296aa)，L-periaxin的C末端區(qū)域(1368-1461aa)與Ezrin的C末端(475-5

6、85aa)。鑒于NLS區(qū)域存在三段序列分別為NLS1/NLS2/NLS3，針對(duì)NLS與Ezrin的FERM結(jié)構(gòu)域作用的區(qū)域，利用熒光共定位與GST-pull down實(shí)驗(yàn)揭示L-periaxin的NLS3參與與Ezrin的FERM結(jié)構(gòu)域相互作用。
　　其次，通過對(duì)Ezrin567位Thr點(diǎn)突變?yōu)楣劝彼?Glu，E)或丙氨酸(Ala，A)，分別模擬永久磷酸化與去磷酸化的狀態(tài)，利用免疫熒光共定位觀察到 Ezrin567位Thr模擬磷酸

7、化后，Ezrin和L-periaxin可共定位在細(xì)胞膜上，而去磷酸化后則不可以，表明該位點(diǎn)的磷酸化可能能夠引導(dǎo)Ezrin自身及L-periaxin定位細(xì)胞膜。但Thr的磷酸化對(duì)二者間的相互作用并沒有明顯的影響。
　　最后，構(gòu)建一對(duì)L-periaxin基因的TALENs載體，轉(zhuǎn)染進(jìn)入RSC96細(xì)胞，通過挑取單克隆，篩選出敲除L-periaxin基因的細(xì)胞株，其兩個(gè)拷貝靶位點(diǎn)敲除的堿基數(shù)分別是23bp和10bp，可以造成L-peria