hCD1d二聚體的制備及其在純化過程的構(gòu)象穩(wěn)定性分析.pdf

1、CD1d是一種MHCI類分子類似物，與MHCI類分子主要提呈抗原肽不同，CD1d主要提呈脂類、糖脂類抗原給自然殺傷性T細(xì)胞（NKT）。作為NKT細(xì)胞的配體，CD1d多聚體為NKT細(xì)胞的相關(guān)研究提供了鑒定與功能調(diào)控的手段。本研究擬制備人CD1d二聚體（hCD1d二聚體），為后續(xù)深入研究NKT細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴pFastBacTMDual＋［β2m＋CD1d/IgG1-Fc］昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建。為了構(gòu)建

2、pFastBacTMDual＋［β2m＋CD1d/IgG1-Fc］表達(dá)質(zhì)粒，選用本課題組前期已經(jīng)建立的pFastBacTMDual＋［β2m］質(zhì)粒作為載體，該載體中P10啟動子下游已經(jīng)重組入正確的人β2m編碼基因。應(yīng)用人CD1d及IgG1-Fc特異性引物分別從人PBMC中擴(kuò)增hCD1d（α1-α3）與IgG1-Fc（CH1-CH3區(qū)）編碼基因。通過酶切位點(diǎn)將hCD1d與 IgG1-Fc融合基因插入到 pFastBacTMDual＋［β2

3、m］ Ph啟動子下游，獲得pFastBacTMDual＋［β2m＋CD1d/IgG1-Fc］表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)過特異性引物PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和DNA堿基序列測定證實(shí)構(gòu)建的質(zhì)粒正確插入了目的基因。
　?、苃CD1d二聚體的表達(dá)及鑒定。將攜帶目的基因的pFastBacTMDual＋［β2m＋CD1d/IgG1-Fc］質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)座作用轉(zhuǎn)入桿狀病毒載體，并轉(zhuǎn)染到草地貪夜蛾sf9細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后5天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，此上清中含有可表達(dá)hCD1

4、d二聚體的桿狀病毒顆粒。利用此上清繼續(xù)感染細(xì)胞，對感染每一代病毒的細(xì)胞上清進(jìn)行hCD1d二聚體水平檢測，結(jié)果顯示感染第四代病毒的細(xì)胞上清中hCD1d二聚體表達(dá)量最高。收集感染第四代病毒的細(xì)胞上清，用特異性的抗體進(jìn)行ELISA及Western-Blot檢測鑒定。結(jié)果證實(shí)獲得具有正確構(gòu)象與分子量的hCD1d二聚體。
　?、莌CD1d二聚體的純化。由于hCD1d二聚體含有IgG1-Fc片段，本研究利用金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA）對hC

5、D1d二聚體進(jìn)行純化。然而實(shí)驗(yàn)顯示傳統(tǒng)的洗脫液（pH4.5的0.1M甘氨酸）不能有效的洗脫hCD1d二聚體。比較pH2.5的0.1M甘氨酸、pH2.5的0.5M甘氨酸、pH2.5的1M甘氨酸、pH2.5的0.1M乙酸、pH1.9的0.1M鹽酸和pH2.5的0.1M檸檬酸等六種不同洗脫液洗脫效果，結(jié)果顯示pH2.5的0.1M檸檬酸洗脫能夠較好的濃縮純化hCD1d二聚體。
　　⑷HLA-A2二聚體與hCD1d二聚體在純化過程中的構(gòu)象穩(wěn)

6、定性分析。HLA-A2為經(jīng)典MHC I類分子，本室之前構(gòu)建表達(dá)的HLA-A2二聚體是HLA-A2與IgG1-Fc的融合蛋白。通過比較HLA-A2二聚體與hCD1d二聚體在純化過程中構(gòu)象的改變，發(fā)現(xiàn)在SPA親和層析過程中，大部分純化的hCD1d二聚體中hCD1d與β2m可以維持完整構(gòu)象（完整構(gòu)象率％：71.4%±30.1%，n=3），而大部分純化的HLA-A2二聚體中β2m脫落、導(dǎo)致構(gòu)象改變（完整構(gòu)象率%：13.7%±13.7%，n=2）