微生物酶法轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-半胱氨酸相關(guān)酶系的研究.pdf

1、L-半胱氨酸是一種重要的含硫氨基酸,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品以及飼料工業(yè).從土壤篩選獲得了一株假單胞菌TS1138,可轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-半胱氨酸.該研究從菌株鑒定、產(chǎn)物的鑒別、產(chǎn)酶及酶促反應(yīng)條件、關(guān)鍵酶的分離純化、酶學性質(zhì)以及轉(zhuǎn)化酶基因的克隆和表達等方面進行了研究,研究結(jié)果如下:從富含DL-ATC的環(huán)境中篩選到一株可轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-半胱氨酸的菌株TS1138,利用形態(tài)學特征、生理生化特征、G+Cmol﹪、16SrDNA

2、序列同源性對TS1138菌株進行了初步分類鑒定,結(jié)果表明該菌株可能屬于惡臭假單胞菌能夠利用DL-ATC轉(zhuǎn)化合成L-半胱氨酸的一個亞種.將酶法轉(zhuǎn)化生成的產(chǎn)物氧化后利用陽離子交換樹脂進行了分離純化,得到L-胱氨酸結(jié)晶.酶促反應(yīng)后的產(chǎn)物經(jīng)比旋光度、DTNB對巰基的特異性反應(yīng)、Rf值、紫外掃描圖譜以及高效液相色譜進行檢測后為L-半胱氨酸.建立了最佳酶促反應(yīng)條件:完整細胞酶液(細胞培養(yǎng)液5倍濃縮)在43℃、pH8.0、DL-ATC底物濃度6g/L

3、時,進行酶促反應(yīng)時轉(zhuǎn)化率最高達到59.9﹪;超聲波破壁后酶液(5倍濃縮)在37℃、pH8.0、DL-ATC底物濃度為6g/L時進行酶促反應(yīng)時轉(zhuǎn)化率最高達到79.1﹪.以pBluescript SKⅡ為載體,以大腸桿菌DH5α為受體菌,構(gòu)建了TS1138菌株的基因組DNA鳥槍法隨機文庫,檢驗證明文庫具有較好的完整性和代表性.然后以大腸桿菌w3110cysB<'->為受體菌重新構(gòu)建TS1138菌株的基因組DNA的隨機文庫,并建立特異性的篩選

4、模型,從文庫中篩選到一株可轉(zhuǎn)化DL-ATC為L-半胱氨酸的重組菌株.針對ORF1構(gòu)建兩個重組質(zhì)粒pET21a-ORFb和pBlue-ORFb;針對ORF2構(gòu)建兩個重組質(zhì)粒和pBlue-ORFc和pET21a-ORFc.將重組質(zhì)粒pET21a-ORFb、pET21a-ORFc分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)誘導后發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒中的ORF1和ORF2均能夠得到很好地表達;將重組質(zhì)粒pBlue-ORFb和pBlue-ORFc分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α

5、,經(jīng)誘導后發(fā)現(xiàn)ORF1的表達產(chǎn)物可以催化L-ATC合成L-SCC,ORF2的表達產(chǎn)物可以催化L-SCC合成L-半胱氨酸.由此說明ORF1編碼的產(chǎn)物為L-ATC水解酶,ORF2編碼的產(chǎn)物為L-SCC酰胺水解酶.在分子水平上證明了在TS1138菌株中,從DL-ATC酶法轉(zhuǎn)化合成L-半胱氨酸經(jīng)S-代的途徑進行.與日本Shiba和Ohmachi報道的假單胞菌BS和ON-4a菌株從DL-ATC酶法轉(zhuǎn)化合成L-半胱氨酸N-代途徑關(guān)鍵酶的基因均有明顯