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文檔簡介
1、桑樹黃化型萎縮病是由植原體引起的毀滅性病害,由于植原體分離、培養(yǎng)困難,目前該病發(fā)生的分子機制仍不清楚。植物miRNAs作為一種重要的調(diào)控因子,在植物防衛(wèi)體系中扮演重要角色。代謝物是細胞調(diào)控過程的終產(chǎn)物,其種類和數(shù)量變化是生物體對體內(nèi)外環(huán)境變化的最終響應。
本研究利用高通量測序的小RNA數(shù)字化分析技術,探討了植原體侵染對桑樹miRNAs表達譜的的影響,鑒定出了桑樹響應植原體侵染的miRNAs,初步揭示了基于miRNAs水平上
2、的桑樹響應植原體侵染的調(diào)控機制;同時利用代謝組學分析技術分析了植原體侵染引起的桑樹葉片和韌皮部汁液代謝組的變化,研究結果對于全面揭示桑樹黃化型萎縮病發(fā)生的分子機制具有重要意義,同時為桑樹功能基因組的研究奠定了基礎,為植原體病害的防治技術研究提供了參考。
本文的主要研究結果是:
(1)桑樹響應植原體侵染的miRNAs差異表達分析成功地構建了感病和健康桑樹葉片小RNA文庫,并利用Illumina Solexa測序
3、技術對其進行了HiSeq測序。在感病和健康桑樹葉片中共鑒定了166種保守的miRNAs,分屬于146個miRNA家族。所鑒定的166種保守miRNAs中有62種miRNAs在感病和健康桑樹葉片中表達量差異顯著,其中在感病桑樹葉片中表達量升高的有25個,下降的有37個;利用Mireap預測得到23個新的miRNAs,分屬于20個miRNA家族;在所鑒定的新miRNAs中有13個在感病和健康桑樹葉片中表達差異顯著,其中有6個miRNAs在受
4、植原體侵染的感病桑樹中上調(diào),7個miRNAs下調(diào),以上分析結果的可靠性通過定量PCR分析得到了證明。
(2)差異表達miRNAs的靶基因功能分析根據(jù)已有的桑樹轉錄組信息和其他植物基因組信息,利用生物信息學技術對62個差異表達的保守miRNAs和13新miRNAs的靶基因進行了預測,分別預測到329和70個靶基因,根據(jù)靶基因的功能和調(diào)控的代謝途徑,可以分別將之歸為15和14類。這些靶基因的功能和所涉及的調(diào)控途徑主要是代謝、發(fā)
5、育、信號傳導等。本研究不僅證明了桑樹響應植原體侵染調(diào)控網(wǎng)絡的復雜性,并對miRNAs介導的桑樹響應植原體侵染的分子機制進行了分析。
(3)桑樹響應植原體侵染的miRNA前體基因的克隆及其植物表達載體構建根據(jù)已有的桑樹轉錄組信息,利用PCR技術克隆得到桑樹miR393a和miR393b前體基因,同時分別從桑樹基因組和cDNA文庫中克隆得到桑樹miR482前體基因并成功構建了其植物表達載體,為進一步研究相關miRNAs在桑樹響
6、應植原體侵染過程中的功能及調(diào)控機制奠定了基礎。
(4)植原體侵染對桑樹代謝組影響的研究利用GC-MS技術分析了健康和感病桑樹葉片中極性代謝物,兩個樣品中共鑒定出153種代謝物;在鑒定的代謝物中,有18種只在感病桑樹葉片中檢測到,而健康葉片中特有的代謝物僅有5種;兩樣品共有的代謝物有130種,其中有65種代謝物濃度在兩樣品中差異明顯,在感病桑樹葉片中濃度升高的只有13種,在感病葉片中減少的有52種。采用相同的技術分析了健康和
7、感病桑樹韌皮部汁液中極性代謝物,兩個樣品中共鑒定出147種代謝物;18種代謝物只在植原體感染的桑樹汁液中檢測到,而在健康的桑樹汁液中則有15種特有的代謝物;在114種共有的代謝物中,有56種代謝物濃度有顯著變化;被侵染的桑樹汁液中有25種代謝物水平增加,31種代謝物水平降低。將不同株系健康和感病桑樹葉片及韌皮部汁液的代謝物成分含量進行主成分分析,結果表明,桑樹葉片與韌皮部汁液樣品代謝組顯著不同,感病與健康植株樣品的代謝組也不同。在此基礎
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