BK通道門控、轉(zhuǎn)運和結(jié)合位點的研究.pdf

1、離子通道作為一種膜蛋白在動物、植物、單細(xì)胞或多細(xì)胞生物的細(xì)胞膜上廣泛存在，產(chǎn)生細(xì)胞生物電現(xiàn)象。鈣依賴、電壓激活的大電導(dǎo)鉀通道（BK通道）作為鉀離子通道家族中的一員，在線蟲、昆蟲和哺乳動物的肌肉、腦、胰腺、背根神經(jīng)節(jié)上都有表達(dá)。BK通道的a亞基不同剪接變體和四種β亞基一起促成了其電流和功能的多樣性。 β2亞基通過其N端的三個疏水性氨基酸FIW產(chǎn)生了失活的BK電流。本文以BK通道b2亞基為研究對象，以HEK293細(xì)胞為工具，利用免疫

2、熒光技術(shù)，共聚焦顯微鏡技術(shù)，結(jié)合分子生物學(xué)和電生理學(xué)方法，研究了β2亞基的轉(zhuǎn)運機制，探索了其與a亞基的結(jié)合位點。主要內(nèi)容如下： （1）通過在β2的N端增加三個疏水性的氨基酸FIW（dFIW），發(fā)現(xiàn)沒有記錄到預(yù)期的失活加強的BK電流，而是記錄不到任何電流。通過熒光實驗發(fā)現(xiàn)這種突變體dFIW造成了其本身和共表達(dá)的a亞基的ER滯留。通過突變其N端的帶電荷的氨基酸D16E17和E44D45，發(fā)現(xiàn)突變體E44D45能使大部分的a亞基上膜，

3、同時能記錄到?jīng)]有失活的BK電流。本文推斷E44D45是結(jié)合位點之一。 （2）通過在β2亞基的胞外部分加入抗原決定簇c-myc，利用熒光素耦聯(lián)的抗體檢測發(fā)現(xiàn)β2亞基不同于b1亞基，它單獨不能被運輸?shù)紿EK細(xì)胞膜上，而是被滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）。但與a亞基共表達(dá)可以被a亞基帶上膜。通過切掉其N端或C端的一些序列我們發(fā)現(xiàn)β2亞基N端的一段a螺旋（18-31）造成了其ER滯留。通過在其loop的不同位置加抗原，發(fā)現(xiàn)K137附近是最容易被抗

4、體接近的區(qū)域。 小鼠mslo1形成的BK單通道電流有較長的開放，但線蟲dslo（A2/C2/E2/G5/10）在開放時卻非常flickery。本文還以BK通道a亞基為研究對象，以非洲爪蟾卵母細(xì)胞為工具，利用電生理技術(shù)研究BK通道的門控機制。主要內(nèi)容如下： 本研究發(fā)現(xiàn)mSlo的突變體I323T會產(chǎn)生跟dslo（A2/C2/E2/G5/10）類似快速開放的單通道電導(dǎo)，并且還有外向整流的性質(zhì)。而突變dslo（A2/C2/E2/

5、G5/10）相應(yīng)位置的親水性氨基酸T337I，發(fā)現(xiàn)該通道開放的單通道電導(dǎo)不再flickery。通過單通道電導(dǎo)分析發(fā)現(xiàn)突變體I323T存在不同亞態(tài)的亞電導(dǎo)，這是因為四個亞基之間的協(xié)同性被破壞造成的。通過對mSlo的I323位點做一系列的突變，發(fā)現(xiàn)越疏水性的氨基酸會產(chǎn)生越長的單通道電導(dǎo)。分子動力學(xué)模擬表明位于BK通道孔道的四個疏水性氨基酸I323在通道門控過程中起著“開關(guān)”作用。因此，本研究證明BK通道的亞電導(dǎo)是由于323位置的四個氨基酸殘