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文檔簡介
1、合浦珠母貝(Pinctadafucata)又稱馬氏珠母貝,是世界上培育海水珍珠的主要種類之一,在我國主要分布于廣東、廣西、海南及臺灣省沿海,我國合浦珠母貝所產(chǎn)珍珠即為國際上享譽(yù)盛名的“南珠”。海水珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)是我國華南沿海地區(qū)的特色經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)之一。近年來,南于海區(qū)污染、養(yǎng)殖病害頻發(fā)和種質(zhì)資源衰退,致使養(yǎng)殖合浦珠母貝出現(xiàn)了死亡率高、生長緩慢等現(xiàn)象,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,成為制約海水珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的技術(shù)瓶頸之一。因此,急需開展合浦
2、珠母貝遺傳選育和分子免疫調(diào)控機(jī)制研究,培育具有優(yōu)良性狀的新品種,發(fā)展新的免疫防治策略,促進(jìn)合浦珠母貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。
本研究在前期選育的基礎(chǔ)上,以F3代不同殼色品系合浦珠母貝為親本,構(gòu)建了F4代不同殼色選育家系,利用傘同胞家系評價(jià)了生長性狀的遺傳力水平;篩選克隆了合浦珠母貝過氧化氫酶(Catalase,PoCAT)和抗菌肽theromacin(antimicrobialpeptides,PoAP)基因,研究了其組織表達(dá)
3、和調(diào)控模式,檢測了重組抗菌肽的抗菌活性,證實(shí)了其對革蘭氏陰性菌具有強(qiáng)烈的抑菌作用,而對革蘭氏陽性菌無抑菌作用。具體結(jié)果如下:
1、合浦珠母貝殼色家系的建立及生長性狀的比較
采用雌雄單個配對,成功建立合浦珠母貝殼色全同胞家系20個。對其6個月齡的生長性狀進(jìn)行了比較,結(jié)果表明,BSF4-3、RSF4-1、RSF4-2和RSF4-5具有明顯的生長優(yōu)勢,可作為進(jìn)一步定向培育生長快速、個體大的合浦珠母貝的材料。殼寬系數(shù)
4、的比較發(fā)現(xiàn),BSF4-3殼寬系數(shù)最大,RSF4-5、WSF4-2、WSF4-3則次之。RSF4-1與RSF4-2相對較低。對不同殼色選系生長比較發(fā)現(xiàn)紅色選系和黑色選系存在明顯的生長優(yōu)勢,顯著性大于其他殼色選系。其次為金色選系,而白色選系的生長最慢。
2、合浦珠母貝幼體生長性狀的遺傳力及其相關(guān)性分析
以海南陵水新村港養(yǎng)殖的金殼(Gp)、黑殼(Bp)、白殼(Wp)和紅殼(Rp)合浦珠母貝不同殼色選育群體為親貝,采
5、用雌雄單個配對和人工授精的方法,獲得金殼家系4個,黑殼家系5個,白殼和紅殼家系各3個。分別在受精后5天、15天、25天和40天,從各個家系中隨機(jī)取樣50個幼體,測量其殼長及殼高,利用方差分析比較殼色系的生長差異。同時利用非求導(dǎo)約束最大似然法(DF-REML),對合浦珠母貝在5、15、25、40日齡下的殼長和殼高性狀進(jìn)行遺傳參數(shù)的估計(jì)。結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)期間,4種殼色系的平均殼長和殼高均存在顯著性差異(p<0.05),40個日齡下,白色選系均
6、具有最大殼長及殼高,金色選系均存在最小殼長和殼高。5~40日齡幼體殼高狹義遺傳力估計(jì)值為0.17~0.23,殼長狹義遺傳力估計(jì)值為0.12~0.22。合浦珠母貝幼體不同生長時期殼高和殼長的遺傳相關(guān)和表型相關(guān)均為正相關(guān),相關(guān)系數(shù)的范圍分別為0.825~0.989,0.832~0.965,表明以殼高或殼長為參數(shù)進(jìn)行選育時,均可達(dá)到改良生長性狀的效果。
3、合浦珠母貝過氧化氫酶基因特征和表達(dá)分析
過氧化氫酶(Cat
7、alase)是機(jī)體內(nèi)一類重要的抗氧化酶,能保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的破壞,在牛物體抗氧化能力以及免疫防御方面起到重要作用。本文研究了合浦珠母貝過氧化氫酶基因結(jié)構(gòu)特征和在應(yīng)激狀態(tài)下的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,合浦珠母貝過氧化氫酶基因PoCAT的cDNA序列全長為2428bp,其中5’-UTR為140bp,3’-UTR為749bp,ORF為1539bp,可編碼512個氨基酸,分子量大約為58.05kDa,等電點(diǎn)為8.4。序列分析顯示,在3’-UTR區(qū)含3個R
8、NA不穩(wěn)定信號結(jié)構(gòu)域(ATTTA)和一個位于polyA上游18bp處的加尾信號AATAAA。預(yù)測的氨基酸序列不含信號肽,說明該蛋白可能為胞內(nèi)蛋白。PoCAT中存在CAT家族的簽名序列350RLFSYSDT358、活性位點(diǎn)序列60FNRERIPERVVHAKGAGA78、12個NADPH潛在的結(jié)合位點(diǎn)(N145,H191,F(xiàn)95,S198,R200,N210,Y212,K234,I299,W300,H302,Y355)、兩個N糖基化位點(diǎn)N
9、436YS438、N478FS480以及三個催化位點(diǎn)His72,Asn145和Tyr355。利用MatGAT軟件對PoCAT氨基酸序列和其它物種CAT序列進(jìn)行同源性和相似性分析,結(jié)果表明PoCAT與其它物種CAT序列具有較高的保守性,同源性為62.3%-82.2%,相似性為73%-92%。組織表達(dá)模式分析表明PoCATmRNA在消化腺、鰓、性腺、腸和外套膜中都有表達(dá)。免疫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在2h、4h和12h時PoCAT基因在腸中的表達(dá)
10、顯著上調(diào),表明PoCAT可能參與了合浦珠母貝的先天免疫應(yīng)答反應(yīng)。
4、合浦珠母貝抗菌肽theromacin的基因克隆及原核表達(dá)
抗菌肽是生物體產(chǎn)生的一類多肽,具有分子量小,熱穩(wěn)定,水溶性好,無免疫原性,抗菌譜廣等特點(diǎn),對真菌、細(xì)菌等病原微生物具有抑制或殺滅作用,通常被稱為“第二防御體系”。Theromacin是一類已被證實(shí)有抗微生物作用的抗菌肽,在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中起著重要的作用。合浦珠母貝的抗菌肽therom
11、acin基因(PoAP)全長522bp,其中5’-UTR為6bp,3’-UTR為141bp,ORF為375bp,可編碼124個氨基酸,分子量大約為13.67kDa,等電點(diǎn)為9.25。序列分析顯示,在3’-UTR區(qū)含1個RNA不穩(wěn)定信號結(jié)構(gòu)域(ATTTA)和位于polyA上游18bp處的一個典型的polyA加尾信號AATAAA。推導(dǎo)的多肽包括信號肽和成熟肽兩個部分,根據(jù)SignalP3.0在線軟件推斷卅信號肽的切割位點(diǎn)在Gla33和Trp
12、34之間,產(chǎn)生含有33個氨基酸的信號肽;預(yù)測成熟肽分子量為9889.4D,等電點(diǎn)Ip9.14,含有12個Cys結(jié)構(gòu),13個堿性氨基酸殘基Arg和Lys。經(jīng)TMpred在線軟件分析出PoAP存在一個跨膜螺旋結(jié)構(gòu),在Val13到Ser34之間,表明PoAP是一個跨膜蛋白。利用MatGAT軟件對PoAP氨基酸序列與其它已知theromacin序列分析顯示PoAPtheromacin與其它已知theromacin序列的相似性為29.0-46.8
13、%。構(gòu)建進(jìn)化樹結(jié)果,顯示PoAP與其他物種的theromacin聚類到一起。將該基因定向克隆到原核表達(dá)載體pET-32α中,在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)出帶His-tag的融合蛋白,分子量約為31kDa,人小與預(yù)期一致。對重組蛋白進(jìn)行純化,并利用純化的蛋白對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌效果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,合浦珠母貝theromacin蛋白對革蘭氏陰性菌存在明顯的溶菌效果,而對革蘭氏陽性菌沒有抑菌活性。這說明合浦珠母貝抗菌肽th
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