水稻鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白基因影響生長發(fā)育和硝酸根吸收轉(zhuǎn)運的作用機制.pdf

1、鉀(K)作為植物的三大營養(yǎng)元素之一，是植物體內(nèi)最大量的陽離子，在其眾多生理生化過程中起重要作用。硝態(tài)氮是植物（包括水稻）從土壤中吸收的主要無機氮源，其從地下部向地上部的轉(zhuǎn)運需要鉀離子（K+）作為伴隨離子來維持電荷平衡。植物對K+的吸收和轉(zhuǎn)運主要是由K+通道與K+轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)，其中鉀轉(zhuǎn)運蛋白在植物缺K條件下對K+的吸收及轉(zhuǎn)運具有重要影響。在水稻中，KT/KUP/HAK是最大的K+轉(zhuǎn)運蛋白家族，我們前期的研究結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)運蛋白家族成員Os

2、HAK1與OsHAK5（Chen et al.，2015;Yang et al.，2014）在低K條件下對水稻K+吸收以及K+由根系向地上部的轉(zhuǎn)運有著顯著貢獻，但是這兩個蛋白的功能并不完全相同，OsHAK1偏重水稻K+吸收、而OsHAK5則偏重K+從地下向地上的轉(zhuǎn)運。我們在多年的田間試驗中發(fā)現(xiàn)，沉默（敲除）OsHAK1基因?qū)е滤靖瞪L受到抑制、有效分蘗減少、株高變矮并且結(jié)實率大幅降低。另外我們也發(fā)現(xiàn)無論在低K和高K供應(yīng)情況下，該基因

3、的敲除導(dǎo)致水稻中K+的含量（濃度）和產(chǎn)量極其顯著的同步下降。為此，本實驗以水稻高親和轉(zhuǎn)運蛋白基因OsHAK1為研究對象，通過研究突變體oshak1與野生型形態(tài)的差異、內(nèi)源生長素含量、[3H]-IAA運輸以及PIN家族的基因表達來闡明OsHAK1影響水稻形態(tài)的機理;通過比較突變體oshak1與野生型花器官形態(tài)與花粉萌發(fā)的不同來研究OsHAK1對水稻育性的影響;通過對15N的示蹤以和水稻體內(nèi)NO3-的含量來分析比較OsHAK1與OsHAK5

4、對水稻NO3-吸收和體內(nèi)運輸?shù)挠绊?。具體研究結(jié)果終結(jié)如下:
　　1、通過正常K(1mM)與缺K(0.1 mM)條件下水稻根系形態(tài)的研究，我們發(fā)現(xiàn)0.1 mM培養(yǎng)條件下，在苗齡為10天的水稻幼苗中，突變體oshak1根毛長度比野生型降低了40％，側(cè)根密度與側(cè)根長度也降低20％左右，而側(cè)根生長區(qū)的K+含量并沒有與野生型表現(xiàn)出顯著差異，說明OsHAK1敲除造成的根系形態(tài)改變并不僅僅是由于根系K+的吸收和運輸受到抑制所導(dǎo)致的。
　　

5、2、許多研究表明，植物的根系形態(tài)受生長素極性運輸?shù)恼{(diào)控。我們對7天苗齡的突變體oshak1與野生型根尖生長素流速的檢測發(fā)現(xiàn)，敲除OsHAK1后制了生長素的跨細(xì)胞運輸，而超表達OsHAK1則可以促進根尖表皮的生長素跨細(xì)胞運輸，敲除OsHAK1也改變了水稻根系中OsPIN1與OsPIN2的表達。通過根尖施加[3H]-IAA發(fā)現(xiàn)，5個小時后突變體oshak1根系1-3 mm、3-5 mm，5-7 mm，7-9 mm，9-11 mm處的[3H]

6、-IAA濃度均比野生型低50％以上，說明生長素向上運輸受阻。而在根基施加外源生長素，8小時內(nèi)突變體oshak1根部[3H]-IAA含量與野生型并沒有明顯差異，只是在18小時后，突變體oshak1根系[3H]-IAA含量高于野生型60％。這一結(jié)果進一步說明OsHAK1的敲除抑制了生長素從根尖向根基部的極性運輸，而對生長素從根基向根尖的極性運輸并沒有顯著抑制。
　　3、胞間pH影響生長素的極性運輸，低pH可以促進IAA質(zhì)子化從而直接滲

7、透進入細(xì)胞。我們通過調(diào)控培養(yǎng)基pH檢測OsHAK1基因?qū)λ靖迪虻匦砸约案馍L素流速實驗發(fā)現(xiàn)，低pH條件下敲除OsHAK1減弱了水稻根系的向地性，生長素在根系中的流動也受到抑制。說明了OsHAK1可能通過調(diào)節(jié)水稻根系的pH穩(wěn)態(tài)平衡，從而影響生長素的吸收轉(zhuǎn)運。
　　4、通過對開花期水稻花器官的觀察，我們發(fā)現(xiàn)敲除OsHAK1導(dǎo)致水稻花器官發(fā)育遲緩、花藥畸形變短、雌蕊柱頭變短變小。我們利用掃描電鏡掃描花粉粒發(fā)現(xiàn)突變體oshak1花粉

8、粒發(fā)育不完全、花粉內(nèi)淀粉等內(nèi)容物減少，并且突變體oshak1癟殼狀花粉粒多于野生型，花粉粒活性降低了50％左右。結(jié)果證明OsHAK1在花粉發(fā)育過程中起著重要作用。另外我們通過花粉的體外、體內(nèi)萌發(fā)實驗發(fā)現(xiàn)敲除OsHAK1抑制了花粉的蒴發(fā)率以及花粉管的長度，表明OsHAK1對花粉管的萌發(fā)和伸長有突出貢獻。另外基因敲除導(dǎo)致柱頭羽狀突出變小，柱頭上黏附的花粉明顯小于野生型。我們的正反雜交試驗結(jié)果也展示OsHAK1同時影響水稻雌、雄器官的育性。<

9、br>　　5、通過對OsHAK1對NO3的吸收分析發(fā)現(xiàn)，在低鉀(0.3 mM)條件下，突變體oshak1水稻的15N-NO3-吸收速率顯著降低，說明OsHAK1是低K條件下水稻吸收NO3-的限制因素之一。我們對突變體oshak1、超表達與野生型材料24小時內(nèi)15N-NO3-轉(zhuǎn)運、植株以及傷流液中NO3-含量的分析發(fā)現(xiàn)，在低K情況下，突變體oshak1根系中NO3-向地上部的轉(zhuǎn)運變少，同時超表達OsHAK1可以促進低鉀(0.3 mM)條件

10、下水稻地下部NO3-向地上部的轉(zhuǎn)運。
　　6、OsHAK5是水稻HAK家族中與OsHAK1同亞族的基因成員，相較其它成員，這兩個基因有著最高的同源性。OsHAK5在低K條件下對水稻根系K+的吸收以及向地上部轉(zhuǎn)運有重要貢獻。我們通過突變體oshak5、超表達與野生型材料對NO3-的吸收分析發(fā)現(xiàn)，低K條件下超表達OsHAK5可以促進水稻對NO3-的吸收以及向地上部的轉(zhuǎn)運。在24小時內(nèi)15N-NO3-的轉(zhuǎn)運實驗以及植株NO3-含量的分析

11、中我們發(fā)現(xiàn)，在低K(0.3mM)培養(yǎng)條件下，OsHAK5影響NO3-向葉片的轉(zhuǎn)運。
　　綜上所述，OsHAK1作為K+轉(zhuǎn)運蛋白，對水稻根部生長素極性運輸（根尖到根基）起重要作用，對水稻花粉的發(fā)育與萌發(fā)有顯著影響。另外OsHAK1與OsHAK5對水稻體內(nèi)NO3-的吸收以及水稻體內(nèi)NO3-與K+的穿梭運輸均有一定影響，但兩者之間仍呈現(xiàn)顯著差異。本研究表明，通過分子遺傳改良，選擇性改變鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達可以調(diào)控禾本科作物的根系生長