降鈣素對大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎潛在保護作用及其機制.pdf

1、第一部分：降鈣素對前交叉韌帶切斷大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的影響
　　目的：探討早期應(yīng)用降鈣素(calcitonin，CT)干預(yù)對前交叉韌帶切斷(anterior cruciate ligament transection，ACLT)導(dǎo)致的大鼠不穩(wěn)定膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)模型中的關(guān)節(jié)軟骨退變的影響。
　　方法：將30只3月齡SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，隨機分為三組，每組10只動

2、物，即：假手術(shù)組(Sham)、前交叉韌帶切斷+鹽水(normal saline，NS)組(ACLT+NS)和前交叉韌帶切斷+降鈣素組(ACLT+CT)。ACLT+NS組和ACLT+CT組大鼠于右膝關(guān)節(jié)行ACLT術(shù)，術(shù)后ACLT+CT組中大鼠給予CT5 IU/kg/2d皮下注射，ACLT+NS組中大鼠給予等容量NS皮下注射，Sham組中大鼠只做膝關(guān)節(jié)腔打開而不行前交叉韌帶切斷，術(shù)后給予等容量NS皮下注射。造模術(shù)后12周處死各組動物，打開右

3、膝關(guān)節(jié)腔后，觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面并拍照記錄。去除右側(cè)股骨軟組織后，用70％酒精固定大鼠股骨樣本，固定72小時后采用EDTA-2Na制成脫鈣液進行脫鈣處理，約6周后待鈣鹽徹底脫失骨組織變軟，然后行常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明后進行石蠟包埋切片，將厚度約為6-8μm的骨組織石蠟切片分別行番紅-O/快綠(safranin-O/fast green)及蘇木素/伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，用于關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)觀察，

4、同時采用Mankin評分方法定量分析關(guān)節(jié)軟骨損傷情況；采用免疫組化方法檢測各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原(typeⅡ collagen)、蛋白多糖分解酶-4(a disintegrin andmetalloproteinase domain with thrombospondin motifs-4，ADAMTS-4)及基質(zhì)金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)表達情況，應(yīng)用Image pro-P

5、lus6.0軟件對免疫組化陽性蛋白表達情況進行積分光密度(integrated optical density，IOD)計算，定量分析各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨陽性細胞表達差異。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面大體觀察發(fā)現(xiàn)：Sham組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面光滑完整；而ACLT+NS組因行ACLT術(shù)，12周后觀察可見大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面晦澀，可見關(guān)節(jié)面明顯破潰，關(guān)節(jié)周圍可見較大骨贅形成；而給予CT干預(yù)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面顯粗糙，偶見小破潰，

6、關(guān)節(jié)周圍亦有較小骨贅形成。
　　2.關(guān)節(jié)軟骨safranin-O/fast green、HE染色形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：Sham組大鼠關(guān)節(jié)軟骨面完整，軟骨與軟骨下骨界限清晰，基質(zhì)著色均勻一致，細胞排列有序；ACLT+NS組術(shù)后12周大鼠關(guān)節(jié)軟骨關(guān)節(jié)面嚴重破壞，軟骨與軟骨下骨界限模糊不清，基質(zhì)著色不均，細胞呈團簇狀克隆增殖，且分布不均，軟骨細胞數(shù)目明顯減少；ACLT+CT組大鼠軟骨表面可見小裂隙存在，軟骨與軟骨下骨界限較為清楚，基質(zhì)著色較為

7、均一但著色略顯變淺，細胞排列亦稍顯紊亂。
　　3.關(guān)節(jié)軟骨損傷Mankin評分顯示：ACLT+NS組Mankin評分顯著高于Sham組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，ACLT+CT組Mankin評分顯著低于ACLT+NS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，ACLT+CT。組Mankin評分則明顯高于Sham組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.關(guān)節(jié)軟骨免疫組化檢測顯示：ACLT+CT組和ACLT+NS組

8、大鼠軟骨Ⅱ型膠原表達顯著低于Sham組，而兩組ADAMTS-4和MMP-3表達則明顯高于Sham組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ACLT+CT組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達顯著高于ACLT+NS組，而ADAMTS-4和MMP-3表達則明顯低于ACLT+NS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　小結(jié)：在ACLT誘導(dǎo)不穩(wěn)定膝關(guān)節(jié)OA大鼠動物模型中，早期應(yīng)用CT皮下注射能夠刺激軟骨細胞Ⅱ型膠原合成，同時抑制ADAMTS-4和

9、MMP-3表達，減輕由膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定造成的OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷。
　　第二部分：降鈣素對前交叉韌帶切斷大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨作用
　　目的：降鈣素(calcitonin，CT)作為一種骨轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)劑而被用于骨代謝疾病的預(yù)防與治療中。本實驗在大鼠膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切斷(anteriorcruciate ligament transection，ACLT)動物模型基礎(chǔ)上，早期給予CT進行干預(yù)，觀察CT對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨BMD及骨組織形

10、態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。
　　方法：30只3月齡SPF級雄性SD大鼠被隨機分為三組，每組10只動物，分別為：假手術(shù)組(Sham)，即只做大鼠右膝關(guān)節(jié)腔切開而不對前交叉韌帶進行切斷術(shù)；前交叉韌帶切斷+鹽水(normal saline，NS)組(ACLT+NS)和前交叉韌帶切斷+降鈣素組(ACLT+CT)將大鼠右膝關(guān)節(jié)打開并切斷前交叉韌帶，從而造成大鼠膝關(guān)節(jié)的不穩(wěn)定狀態(tài)。造模術(shù)后的ACLT+CT組大鼠即給予CT5 IU/kg/2d皮下注射，AC

11、LT+NS組和Sham組大鼠給予等容量NS皮下注射。12周后應(yīng)用過量水合氯醛腹腔注射處死各組動物，處死前10天和前4天對所有動物依據(jù)體重分別給與四環(huán)素(25mg/kg)及鈣黃綠素(5mg/kg)皮下注射。仔細去除右后肢肌肉等軟組織后，應(yīng)用雙能骨密度測量儀分別測量大鼠膝關(guān)節(jié)股骨軟骨下骨內(nèi)側(cè)髁和外側(cè)髁骨密度(bone mineral density，BMD)。將右側(cè)脛骨置于70％酒精溶液中固定約72小時，然后經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后，將

12、右膝關(guān)節(jié)脛骨置于甲基丙烯酸甲酯溶液中進行硬組織包埋，在硬組織切片機上將每個樣本包埋塊制成厚度約為7-8μm切片兩張，其中一張采用Gemisa試劑進行染色，另一張不行任何染色，分別用于計算軟骨下骨骨小梁結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)：相對體積(bone volume/trabecular volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)及骨小梁分離度(tr

13、abecular separation，Tb.Sp)，骨小梁動態(tài)數(shù)據(jù)包括礦化相對面積(mineral surface，MS/BS)、礦化形成率(mineral apposition rate，MAR)及骨形成率(bone formation rate，BFR/BS)。大體觀察軟骨下骨形態(tài)并采用IPP軟件對軟骨下骨骨小梁結(jié)構(gòu)進行組織形態(tài)計量學(xué)測定，定量分析軟骨下骨結(jié)構(gòu)參數(shù)與動態(tài)參數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)股骨軟骨

14、下骨BMD檢測發(fā)現(xiàn)：ACLT+NS組大鼠內(nèi)、外側(cè)髁軟骨下骨BMD較Sham組大鼠顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CT干預(yù)ACLT術(shù)后大鼠其內(nèi)、外側(cè)髁軟骨下骨BMD顯著高于ACLT+NS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而與Sham組比較，ACLT+CT組大鼠的內(nèi)、外側(cè)髁軟骨下骨BMD顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨軟骨下骨骨組織形態(tài)計量學(xué)結(jié)構(gòu)參數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)：ACLT+NS

15、組大鼠軟骨下骨BV/TV、Tb/Th和Tb/N值較Sham組大鼠顯著降低，而Tb.Sp值較Sham組中大鼠則顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CT干預(yù)ACLT術(shù)后大鼠其軟骨下骨BV/TV、Tb/Th和Tb/N值顯著高于ACLT+NS組中大鼠，而ACLT+CT組大鼠Tb.Sp值較ACLT+NS組中大鼠顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Sham組比較，ACLT+CT組大鼠其軟骨下骨BV/TV、Tb/Th和Tb/N值

16、顯著降低，而Tb.Sp值顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨軟骨下骨骨組織形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)：ACLT+NS組大鼠軟骨下骨MS/BS、MAR和BFR/BS值較Sham組大鼠顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CT干預(yù)ACLT術(shù)后大鼠軟骨下骨MS/BS、MAR和BFR/BS值顯著高于ACLT+NS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而ACLT+CT組軟骨下骨MS/BS、MA

17、R和BFR/BS值顯著低于Sham組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　小結(jié)：CT能夠抑制ACLT誘導(dǎo)的大鼠OA早期膝關(guān)節(jié)軟骨下骨骨量丟失，改善軟骨下骨骨小梁微觀結(jié)構(gòu)，進而維持軟骨下骨生物力學(xué)性能。
　　第三部分：MAPK信號蛋白在降鈣素抑制由白介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-13表達中的作用
　　目的：降鈣素(calcitonin，CT)顯示出一定的軟骨細胞保護作用，本實驗旨在探討CT是否能夠影響

18、MAPKs信號通路，進而抑制由IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞MMP-13表達。
　　方法：取自1月齡SPF級SD大鼠的膝關(guān)節(jié)表面軟骨組織，經(jīng)酶消化后培養(yǎng)軟骨細胞，于第2代軟骨細胞用于實驗，共分為6組，①空白組(control)：給予DMEM培養(yǎng)液孵育24h+15min；②IL-1β組(IL-1β)：于DMEM培養(yǎng)基中孵育24h，然后加入10ng/ml IL-1β再孵育15min；③CT低劑量(Low dosage CT=L)預(yù)處理組(L

19、+IL-1β)：先在含CT50ng/mlDMEM培養(yǎng)基中孵育24h，然后加入10ng/ml IL-1β再孵育15min；④CT高劑量(High dosage CT=H)預(yù)處理組(H+IL-1β)：先在含CT500ng/mlDMEM培養(yǎng)基孵育24h，然后加入10ng/ml IL-1β再孵育15min；⑤CT低劑量對照組(L)：在含CT50ng/ml DMEM培養(yǎng)基24h+15min；⑥CT高劑量對照組(H)：給予含CT500ng/ml D

20、MEM培養(yǎng)基24h+15min。免疫細胞化學(xué)方法檢測軟骨細胞中磷酸化p38(phospho-p38)、磷酸化ERK1/2(phospho-ERK1/2)、磷酸化JNK(phospho-JNK)及MMP-13表達；Western blot方法分別檢測軟骨細胞中磷酸化及總p38(phospho-p38，total p38)、ERK1/2(phospho-ERK1/2，total ERK1/2)、JNK(phospho-JNK，total J

21、NK)及MMP-13蛋白表達情況。應(yīng)用IPP軟件對各組Western blot條帶蛋白表達進行積分光密度(integrated opticaldensity，IOD)計算，定量分析各組不同檢測指標蛋白表達差異。
　　結(jié)果：
　　1.軟骨細胞免疫化學(xué)檢測顯示：與control組比較，IL-1β顯著刺激軟骨細胞MMP-13表達，同時上調(diào)phospho-p38、phospho-ERK1/2和phospho-JNK表達；而CT預(yù)處理

22、的軟骨細胞經(jīng)IL-1β孵育后，其MMP-13、phospho-p38和phospho-ERK1/2的陽性染色表達較IL-1β單純處理組軟骨細胞陽性染色變?nèi)?，但不同劑量CT預(yù)處理后，兩組間MMP-13、phospho-p38和phospho-ERK1/2陽性著色未見顯著差別；與control組比較，不同劑量CT單獨預(yù)處理后，軟骨細胞MMP-13、phospho-p38、phospho-ERK1/2和phospho-JNK表達未見顯著差別。

23、
　　2.軟骨細胞Western blot檢測顯示：IL-1β單純處理組較control組，其MMP-13、phospho-p38、phospho-ERK1/2和phospho-JNK的蛋白表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而total p38、total ERK1/2、total JNK的蛋白表達與control組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CT預(yù)處理的軟骨細胞經(jīng)IL-1β孵育后，其MMP-13、ph

24、ospho-p38和phospho-ERK1/2的蛋白表達較IL-1β單純處理組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而total p38、total ERK1/2、total JNK、phospho-JNK和total JNK的蛋白表達與IL-1β單純處理組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)：高低不同劑量CT對phospho-p38，phospho-ERK1/2及MMP-13蛋白表達調(diào)控作用并無劑量依賴性(P>0.05)；

25、與control組比較，高低不同劑量CT對正常軟骨細胞MMP-13和MAPKs(p38、ERK1/2和JNK)均無影響(P>0.05)。
　　小結(jié)：應(yīng)用CT對軟骨細胞進行預(yù)處理能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞MMP-13表達，同時CT可能通過調(diào)控MAPKs通路中phospho-p38和phospho-ERK1/2表達進而下調(diào)軟骨細胞中MMP-13合成。
　　結(jié)論：早期給予降鈣素干預(yù)能夠減輕實驗性O(shè)A模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，同