可轉(zhuǎn)化人工染色體（TAC）文庫載體DNA制備的研究.pdf

1、大片段基因組文庫是進(jìn)行基因組研究、基因分離及其快速利用的一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)性工作，特別是對(duì)于大基因組生物來說更是如此?？赊D(zhuǎn)化人工染色體(Transformationcompetentartificialchromosome，TAC)載體含P1噬菌體和Ri質(zhì)粒的復(fù)制子，因而能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中以單拷貝形式穿梭復(fù)制。一旦篩選到目標(biāo)陽性克隆，可直接利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將其轉(zhuǎn)到植物體中進(jìn)行基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，省去了亞克隆的步驟。 高質(zhì)量的載

2、體DNA和高質(zhì)量的大片段DNA是文庫構(gòu)建的兩個(gè)基本要素，目前，已有文獻(xiàn)多側(cè)重于文庫的構(gòu)建及利用和高質(zhì)量的大片段DNA的獲得，對(duì)文庫載體DNA制備的研究則少見報(bào)道。本論文以TAC載體pYLTAC17和pYLTAC747H為材料，針對(duì)高質(zhì)量載體DNA制備過程中的關(guān)鍵步驟，如質(zhì)粒載體的分離和純化及檢測(cè)、HindⅢ內(nèi)切酶最佳完全酶切條件選擇、HK脫磷酶最佳完全脫磷效果的載體自連檢測(cè)、載體DNA與lambdaDNA/HindⅢ連接能力的檢測(cè)及轉(zhuǎn)化

3、克隆分析等進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下：用QIAprepSpinMiniprep試劑盒分離純化得到的載體pYLTAC17的濃度是300ng/ul，pYLTAC747H的濃度是400ng/ul；將所提純的兩種載體DNA電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇培養(yǎng)液涂于LB+Kan25mg.L-1(+5％蔗糖)平板，計(jì)算每ul在含有蔗糖和沒有蔗糖的培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落數(shù)的比例，分別是pYLTAC17為1：28885.7，pYLTAC747H為

4、1：119600，均遠(yuǎn)小于1/5000，說明兩種載體DNA中的sacB基因均功能正常，可以繼續(xù)進(jìn)行TAC文庫構(gòu)建的后續(xù)步驟；對(duì)兩種閉環(huán)載體DNA分別用1U、2U、3U、5U和7U共5種不同梯度的HindⅢ酶切處理，電泳檢測(cè)得出最適HindⅢ完全酶切條件是3U/ug閉環(huán)載體DNA，37℃，酶切30min；對(duì)最適HindⅢ酶切條件得到的兩種線性載體DNA，分別用0.5MBU和1MBU共2種不同梯度的HK脫磷酶處理，經(jīng)電泳和載體連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化

5、大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞兩個(gè)方面的檢測(cè)得出最佳HK脫磷酶完全脫磷條件是1MBU/ug線性載體DNA，30℃，脫磷1h；不同酶切、脫磷處理下所制備的兩種線性載體DNA與lambdaDNA/HindⅢ的連接產(chǎn)物經(jīng)電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后涂布于LB+Kan25mg.L-1+5％蔗糖平板上進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)每ug載體DNA經(jīng)3UHindⅢ完全酶切、1MBUHK完全脫磷后的轉(zhuǎn)化頻率最高，pYLTAC17為1.93×108，pYLTAC747H為

6、2.86×108；隨機(jī)挑取兩種載體的轉(zhuǎn)化子各5個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均有不同大小的插入片段，說明所制備載體的連接能力較好；每ugpYLTAC747H載體DNA經(jīng)3UHindⅢ完全酶切、1MBUHK完全脫磷后，與lambdaDNA/HindⅢ的連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌ElectroTen-Blue感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇培養(yǎng)液涂布于pH7.0的LB+12.5mg.L-1潮霉素+5％蔗糖平板上進(jìn)行培養(yǎng)，初步看出比電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率