同型半胱氨酸調控MLCK影響實驗性結腸炎腸粘膜通透性的作用研究.pdf

1、背景：炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease, IBD）是一種目前發(fā)病機制尚不十分明確的慢性腸道炎癥性疾病。既往研究表明，腸道粘膜緊密連接結構的破壞引起腸粘膜通透性增加對 IBD的發(fā)病過程具有重要影響。同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）是一種含硫氨基酸，是甲硫氨酸代謝的重要中間產物。研究發(fā)現(xiàn)Hcy可能通過多種途徑影響內皮細胞屏障功能，提高內皮細胞通透性，促進炎癥反應。炎癥性腸病（IBD）患者血漿

2、和結腸粘膜組織中Hcy水平增高，但Hcy是否通過影響腸上皮細胞緊密連接結構及功能，進一步影響腸粘膜通透性參與IBD的病理生理過程尚不明確。因此，本研究擬在建立大鼠TNBS/乙醇結腸炎模型及人結腸癌Caco-2細胞株的基礎上，探討同型半胱氨酸對實驗性結腸炎腸粘膜通透性及Caco-2細胞單層通透性的影響及其作用機理。
　　目的：探討同型半胱氨酸（Hcy）對實驗性結腸炎大鼠小腸粘膜通透性及Caco-2細胞單層通透性的影響及作用機理。

3、r>　　方法：1. Caco-2細胞經Hcy預處理不同信號通路抑制劑（ERK抑制劑 PD98059, P38MAPK抑制劑 SB203580, Rho抑制劑 Y27632, Ca2+/Calmodulin抑制劑 KN62, PKC抑制劑 Staurosporine以及 MLCK抑制劑 ML-7）之后，加入 FITC。記錄Caco-2細胞TEER隨時間變化情況，同時于 lower chamber取樣，樣品中 FITC濃度通過熒光分光光度計

4、測定。實驗結束后收集細胞懸液，Western blot方法檢測細胞中 MEK，ERK，p-ERK, MLCK, p-MLCK, ZO-1, Claudin-1, Claudin-2, Occludin蛋白表達。2.使用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇灌腸制備實驗性大鼠結腸炎模型，采用皮下注射同型半胱氨酸造成高同型半胱氨酸血癥（HHcy）模型。3. SD雄性大鼠，分成4組：A組為對照組（NS注射+NS灌腸），B組為對照+Hcy注

5、射組（Hcy注射+NS灌腸），C組為TNBS模型組（NS注射+TNBS/乙醇灌腸），D組為TNBS模型+Hcy注射組（Hcy皮注射+TNBS/乙醇灌腸）。4.記錄觀察大鼠每日體重變化及糞便情況，根據(jù)大鼠癥狀及體重變化情況進行疾病活動性評分（DAI），切取實驗性結腸炎大鼠結腸標本行HE染色，并行結腸組織學損傷評分（HI）5.大鼠結腸Hcy及MLCK水平通過ELISA方法檢測，大鼠結腸MPO活性通過四甲基聯(lián)苯胺法測定，大鼠小腸粘膜組織中 M

6、EK，ERK，p-ERK, MLCK, p-MLCK, ZO-1, Claudin-1, Claudin-2, Occludin蛋白表達使用免疫組化及western blot方法測定，MLCK mRNA表達通過RT-qPCR方法檢測。
　　結果：與對照組相比，Caco-2細胞使用50μmol/L Hcy預處理時TEER降低明顯。與Hcy組相比，Caco-2細胞經ML-7及PD98059藥物預處理后TEER下降減緩，F(xiàn)ITC跨膜轉運

7、量有所降低，MLCK，p-MLCK，Claudin-2蛋白表達有所降低，ZO-1，Claudin-1，Occludin蛋白表達有所回升，表明 MEK-ERK-MLCK信號通路在 Hcy影響Caco-2細胞通透性的過程中具有影響。與正常對照組及TNBS模型對照組相比，TNBS模型+Hcy皮下注射組DAI，HI，MPO顯著升高，結腸 MLCK水平明顯增加，大鼠小腸組織中MEK，ERK，p-ERK, MLCK, p-MLCK, Claudin