基于稀土納米管構(gòu)建高效的上轉(zhuǎn)換熒光生物成像劑.pdf

1、目的：光學(xué)生物成像技術(shù)是一種簡(jiǎn)單、高效、靈敏且成本低廉的分子成像技術(shù)，能夠很好的反應(yīng)光與組織之間的相互作用，是一種常見(jiàn)的臨床診療手段。但是光學(xué)生物成像在臨床上的應(yīng)用，很大的程度上受限于傳統(tǒng)熒光成像劑的激發(fā)波長(zhǎng)在可見(jiàn)光范圍(700nm)以內(nèi)，從而導(dǎo)致其組織穿透能力極其有限（約幾毫米）。而眼部由于特殊的生理結(jié)構(gòu)，光學(xué)生物成像技術(shù)在眼科的應(yīng)用更是面臨巨大的挑戰(zhàn)。在本論文中，我們構(gòu)建了以稀土納米管為基礎(chǔ)的新型上轉(zhuǎn)換納米熒光成像劑，可以實(shí)現(xiàn)在近紅

2、外(700-1000 nm)范圍內(nèi)激發(fā)，并在可見(jiàn)光范圍內(nèi)發(fā)射熒光、采集信號(hào)，從而有望將傳統(tǒng)光學(xué)成像的組織穿透能力提高到厘米級(jí)別，有效提高成像分辨率、減少背景干擾，并有望進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)眼部光學(xué)生物成像。我們選用了高熒光強(qiáng)度的鐿(Yb)，鉺(Er)摻雜的硫氧化釓(Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+)，并將其制備成納米管，以便其能更容易的進(jìn)入細(xì)胞與組織，并有效保持熒光性能;同時(shí)通過(guò)制備條件優(yōu)化，控制產(chǎn)物的形貌、尺寸、熒光強(qiáng)度和顏色，為所制備的納米

3、管在生物光學(xué)成像上的應(yīng)用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。為了探討所制各的納米管熒光成像劑在生物成像上的應(yīng)用，本論文還進(jìn)一步對(duì)所得產(chǎn)物的生物相容性，及其在眼部細(xì)胞（如視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞）和動(dòng)物體內(nèi)的成像效果進(jìn)行了初步研究，揭示了所構(gòu)建的納米管熒光成像劑在生物成像與臨床診療上的巨大應(yīng)用前景。
　　方法：⑴Gd(OH)3納米管的制備:將2 mmol的Gd(NO3)3加入到25 mL去離子水中形成澄清溶液，在攪拌條件下，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％的氨水調(diào)節(jié)溶液pH

4、至10。繼續(xù)攪拌10 min，然后將體系加熱到75℃，反應(yīng)18h。將反應(yīng)得到的白色沉淀收集、離心分離，分別用去離子水和乙醇洗滌若干次，在60℃烘箱中干燥24 h。摻雜Er3+，Yb3+的Gd(OH)3納米管的合成與純的Gd(OH)3納米管的合成相似，僅在第一步中用相應(yīng)比例的Er(NO3)3，Yb(NO3)3溶液代替Gd(NO3)3溶液。Gd2O2S∶Er3+/Yb3+納米管的合成:將所得的Gd(OH)3∶ Er3+/Yb3+納米管在氮?dú)?/p>

5、和硫磺的氣氛中于一定溫度下煅燒2小時(shí)。⑵Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+納米管的細(xì)胞毒性檢測(cè)（CCK-8）:將ARPE-19細(xì)胞（一種典型的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株）在96孔板中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞黏附。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中分別加入不同濃度的Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+納米管(25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL和200μg/mL)，以正常培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組。每個(gè)濃度有6個(gè)平行孔，定時(shí)培養(yǎng)24 h，48 h和72 h。隨后通過(guò)C

6、CK-8試劑盒檢測(cè)Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+對(duì)ARPE-19細(xì)胞存活率的影響，分析納米材料的生物相容性。細(xì)胞透射電鏡觀察:以人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19)為研究對(duì)象，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組用100μg/mL的Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+納米管對(duì)細(xì)胞分別處理不同的時(shí)間段(2h，6h，24 h)后，觀察納米材料對(duì)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響。⑶將ARPE-19細(xì)胞接種于24孔板中，孵育24 h。每孔中加入50μg/mL的Gd

7、2O2S∶Er3+/Yb3+納米管培養(yǎng)6h后，利用Hoechst33258染液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，置于倒置熒光顯微鏡下觀察材料是否進(jìn)入細(xì)胞及能否觀察到熒光。⑷Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+納米管在裸鼠體內(nèi)的成像將3％，1mL/Kg的戊巴比妥鈉和0.2mL/Kg的鹽酸甲苯噻嗪皮下注射入裸鼠體內(nèi)以麻醉裸鼠。用10 mg/mL的Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+納米管的水溶液皮下注射入裸鼠體內(nèi)，最后將麻醉的裸鼠置于小動(dòng)物活體成像儀的托盤上，

8、在980 nm激光照射下進(jìn)行體內(nèi)熒光成像的測(cè)試。
　　結(jié)果：成功合成了具有上轉(zhuǎn)換熒光性能的Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+納米管，通過(guò)條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)對(duì)納米材料的形貌、熒光強(qiáng)度和熒光性能等的可控合成。所合成的熒光納米管表現(xiàn)了良好的生物相容性，并在低濃度的時(shí)候?qū)?xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。透射電鏡結(jié)果證實(shí)了所合成的納米管能夠穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。體外細(xì)胞成像結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了所制備的納米管能夠進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，并在近紅外激光(9

9、80 nm)激發(fā)下產(chǎn)生明顯、清晰、低背景的熒光信號(hào)，能夠很好的實(shí)現(xiàn)高效的細(xì)胞內(nèi)成像。小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示所制備的納米管在動(dòng)物體內(nèi)，在近紅外激光的激發(fā)下，能夠檢測(cè)到清晰的熒光信號(hào)，并且無(wú)背景熒光的干擾，表明其在動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像和臨床疾病診療上的巨大應(yīng)用潛能。
　　結(jié)論：通過(guò)合成具有上轉(zhuǎn)換熒光性能的稀土納米管，實(shí)現(xiàn)了在近紅外光的激發(fā)下，產(chǎn)生可見(jiàn)光范圍的熒光，有效提高了光學(xué)生物成像的組織穿透能力與抗背景干擾能力。納米管的特殊形貌，使得

10、納米材料能夠有效的進(jìn)入細(xì)胞與組織內(nèi)部，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞及體內(nèi)的高效生物成像。生物相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所制備的納米管材料對(duì)眼部細(xì)胞具有很好的生物相容性，并且在一定的濃度范圍會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，表明其在眼內(nèi)乃至體內(nèi)生物成像的應(yīng)用可行性。體外細(xì)胞熒光成像和體內(nèi)活體熒光成像結(jié)果表明了所制備的納米管熒光成像劑能夠在近紅外光源激發(fā)下，高效實(shí)現(xiàn)可見(jiàn)光范圍內(nèi)成像，有效的推動(dòng)了光學(xué)成像技術(shù)在臨床（尤其眼科）疾病診斷和治療等方面的應(yīng)用，具有很好的研究與應(yīng)